白细胞介素1αmRNA在结直肠癌中的表达及意义

田维军 张 鑫 赵金伟 侯 波 (吉林省人民医院急诊外科，吉林 长春 130021)

白细胞介素(IL)-1α是一种多功能细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和淋巴细胞合成并分泌，不仅参与炎症反应，而且在肿瘤发生发展中发挥重要作用。体外实验显示，IL-1α在结直肠癌细胞株中明显高表达，可促进肿瘤血管形成，并且与结直肠癌细胞肝转移有关〔1〕。临床实验显示，结直肠癌患者血浆中IL-1α蛋白表达明显升高〔2〕。迄今为止，尚未见结直肠癌中IL-1αmRNA的表达变化研究报道。本研究采用实时荧光定量PCR检测IL-1αmRNA在结直肠癌及癌旁组织中的表达，并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 样本收集 收集手术切除结直肠癌及对应癌旁组织标本42例，其中男 25例，女 17例，年龄 45～69〔平均(57.1±12.4)〕岁。均经组织病理学确诊为结直肠癌，手术切除组织立即液氮冻存。

1.2 实时荧光定量PCR检测 用Trizol法(TRIpure Reagent购自北京百泰克公司)提取结直肠癌组织及癌旁组织总RNA。反转录为cDNA，具体操作按照试剂盒说明书进行(反转录试剂盒购自Fermentas公司)。参照文献〔3〕设计目的基因IL-1α引物:上游:5'-AGAAGAGACGGTTGAGTTTAAGCCAATCCA-3'，下游:5'-CTCAGGAAGCTAAAAGGTGCTGACCTA-3'，扩增片段大小115 bp。内参基因 GAPDH:上游引物:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3';下游引物:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，引物由上海生工生物技术有限公司合成。运用双标准曲线法进行定量分析，按照10、101、102、103和104梯度稀释 cDNA，建立标准曲线。采用20μl反应体系，含有cDNA模板2.0μl，SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μl，上、下 游 引 物(10 μmol/L)各0.2 μl，RNase-free水补足体积至 20 μl。设置反应条件:95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环。反应结束后，设置95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s进行熔解曲线分析。以GAPDH为内对照，RNase-free水代替模板cDNA作为阴性对照。每个样本复孔2管，软件自动记录Ct值。调整基线使目的基因IL-1α和内参基因GAPDH阈值一致，根据标准曲线计算基因的相对表达量。以IL-1α相对表达量/GAPDH相对表达量，得到校正后每个待测样本IL-1α的表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0软件，结直肠癌组织和癌旁组织IL-1αmRNA相对含量比较采用配对t检验，结直肠癌临床特征之间的比较采用两组独立样本t检验。

2 结果

2.1 标准曲线的建立 熔解曲线分析:单峰，高而尖，无锯齿状，表明引物特异性较好，无非特异性扩增。标准曲线分析:目的基因和内参基因的R2均＞0.98，表明直线拟合度较好;根据斜率，电脑自动计算目的基因和内参基因的扩增效率，均＞90%。待测样本之间具有可比性。

2.2 IL-1αmRNA在结直肠癌中的表达 IL-1αmRNA在结直肠癌组织中的相对含量(1.18±0.80)明显高于癌旁组织(0.74±0.49)(t=-3.12，P=0.003)。IL-1α mRNA 在临床Ⅲ～Ⅳ期结直肠癌组织中的相对含量明显高于其Ⅰ～Ⅱ期(P=0.01);IL-1αmRNA在伴有转移结直肠癌组织中的相对含量明显高于其在无转移结直肠癌组织中(P=0.002);IL-1α mRNA在不同分化程度结直肠癌中的表达无明显差异。见表1。

表1 IL-1αmRNA表达与结直肠癌临床特征的相关性(±s)

表1 IL-1αmRNA表达与结直肠癌临床特征的相关性(±s)

临床特征 n IL-1αmRNA相对含量 t值 P值24 1.06±0.71 -1.14 0.26低分化 18 1.34±0.90临床分期 Ⅰ～Ⅱ 22 0.89±0.52 -2.67 0.01Ⅲ～Ⅳ 20 1.50±0.93转移状态 有 19 1.59±0.90 3.40 0.002无分化程度 高中分化23 0.84±0.50

3 讨论

IL-1作为一种多向性细胞因子，不仅影响机体的炎症和免疫反应，而且具有调节机体内环境稳定的功能，在急慢性炎症和肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。IL-1家族包括2个成员:IL-1α和IL-1β，两者通过与IL-1 I型受体结合，参与肿瘤的演变过程。IL-1β可促进结直肠癌细胞增殖、侵袭〔4，5〕。外源性IL-1β干预结直肠细胞后，金属基质蛋白酶及其组织抑制剂基因表达明显增加，这些基因的增加与肿瘤侵袭和转移有关〔6〕。IL-1β不仅与结直肠癌恶性生物学行为有关，而且与患者性别有关，Sharma等〔7〕报道IL-1β在男性结直肠患者中的表达明显高于女性。与IL-1β作用类似，过表达IL-1α可通过调节肿瘤微环境中的基质细胞而促进细胞生长、侵袭、转移和肿瘤血管形成〔1，8〕。结直肠癌患者血浆中 IL-1α 蛋白表达明显升高〔2〕。

本研究提示IL-1α有望作为结直肠癌发病新的生物学标记物。关于IL-1α在结直肠癌发病中的作用机制，至今尚未完全阐明，推测IL-1αmRNA的异常升高导致了IL-1α蛋白表达增加，参与肿瘤恶变过程，介导结直肠癌发生。

1 Matsuo Y，Sawai H，Ma J，et al.IL-1alpha secreted by colon cancer cells enhances angiogenesis:the relationship between IL-1alpha release and tumor cells'potential for liver metastasis〔J〕.J Surg Oncol，2009;99(6):361-7.

2 Hillenbrand A，Fassler J，Huber N，et al.Changed adipocytokine concentrations in colorectal tumor patients and morbidly obese patientscompared to healthy controls〔J〕.BMC Cancer，2012;12:545.

3 Moschen AR，Molnar C，Enrich B，et al.Adipose and liver expression of interleukin(IL)-1 family members in morbid obesity and effects of weight loss〔J〕.Mol Med，2011;17(7-8):840-5.

4 Li Y，Wang L，Pappan L，et al.IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation〔J〕.Mol Cancer，2012;11:87.

5 张 佳，罗和生，钟清连.IL-1β及IL-1ra对结肠癌细胞表达uPA的影响〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2009;18(10):942-4.

6 Kapral M，Wawszczyk J，Jurzak M，et al.The effect of inositol hexaphosphate on the expression of selected metalloproteinases and their tissue inhibitors in IL-1beta-stimulated colon cancer cells〔J〕.Int J Colorectal Dis，2012;27(11):1419-28.

7 Sharma A，Greenman J，Walker LG，et al.Differences in cytokine levels due to gender in colorectal cancer patients〔J〕.Cytokine，2010;50(1):91-3.

8 史新龙，马家驰，杨熊飞，等.白细胞介素1α及其受体拮抗剂对大肠癌细胞增殖、侵袭的影响〔J〕.中国普通外科杂志，2012;21(10):1231-5.