中性粒细胞弹性蛋白酶在颅脑损伤大鼠脑组织中的动态变化

苏 海 贺学农 陈 皓 周昌龙 夏小辉 张 毅 (重庆医科大学附属永川医院神经外科，重庆 402160)

中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)是一种基质金属蛋白酶，广泛存在于中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞内，在机体的组织损伤、炎症反应等病理过程中发挥了重要作用。研究表明NE与脑出血、缺血再灌注等神经系统损害有关〔1，2〕，但是NE与颅脑损伤后的继发性脑损伤的关系尚未有报道。本研究采用液压打击制作颅脑损伤(TBI)大鼠模型，检测脑组织的NE、血脑屏障(BBB)通透性以及脑组织含水率的动态变化，探讨脑组织NE含量的变化对颅脑损伤后的继发性脑水肿的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性健康SD大鼠48只，体重200～250 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，分为对照组8只和TBI组40 只，其中 TBI组又按6、24、48、72、168 h 时间点分为 5个亚组，每亚组8只大鼠，大鼠适应性喂养3 d，造模后SD大鼠按亚组分笼饲养，正常喂食、喂水。

1.2 TBI模型制作 采用 Thompson〔3〕方式制作模型，用100 g/L水合氯醛(3 ml/kg)经腹腔麻醉大鼠，用立体定位仪固定头部，作头皮正中切口，剥离骨膜，前囟人字缝尖连线中点偏左4 mm颅骨钻钻孔，暴露完整硬脑膜。打击管内注满水，与液压脑创伤打击装置连接，造成TBI。

1.3 脑组织NE的测定 对照组和TBI组大鼠分别于相应时间点，经水合氯醛麻醉后，快速断头取脑，取脑组织精确称重，置于-70℃保存备测。测定时将脑组织用生理盐水在冰浴环境内以玻璃匀浆器制成10%的脑组织匀浆。采用酶联免疫吸附双抗夹心法(ELISA)测定。

1.4 BBB通透性的检测 对照组和TBI组大鼠于预定的时间点用2%偶氮蓝(EB)按5 ml/kg经股静脉注入，60 min后，处死大鼠，取大鼠脑组织通过分光光度计定检测渗出的EB。

1.5 脑含水率测定 对照组和TBI组大鼠在预定时间点，经水合氯醛麻醉后，迅速断头取脑，将取出的脑组织放在用生理盐水浸润过的滤纸上，以防止水分蒸发。去除软脑膜和血迹，精密称重。将脑组织置于95℃恒温烘箱24 h，再称取干重。按Blliot公式计算脑含水率=(湿重-干重)/湿重×100%。

2 结果

2.1 TBI大鼠脑组织内NE含量的动态变化 TBI大鼠脑组织内NE含量在6 h开始增高，24 h进一步升高，48 h达到最高峰，72 h开始逐渐下降，直到168 h仍维持在高水平，TBI组各时间点的脑组织NE含量均高于对照组(P＜0.05)。见表1。

2.2 TBI大鼠脑组织EB含量的动态变化 脑组织EB含量与NE含量的变化呈同步性，TBI组各时间点的脑组织EB含量均高于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组各时间点脑组织NE、EB含量、脑含水量的比较(x ± s，n=8)

2.3 TBI大鼠脑组织含水率的动态变化 TBI组大鼠脑组织含水率在6 h开始增高，24、48 h进一步升高，72 h达到最高峰，168 h开始逐渐下降，TBI组各时间点的脑组织含水率均高于对照组(P＜0.01)。见表1。

3 讨论

脑水肿是创伤性颅脑损伤后继发的主要病理生理改变之一，常影响病情的发展和转归，甚至危及患者的生命。由颅脑创伤导致的脑组织水肿是细胞毒性和血管源性的混合性水肿，并且以细胞毒性脑水肿为主〔4〕。国内外众多学者对创伤性颅脑损伤后脑水肿进行了深入研究，其病理生理过程，分子生物学机制及愈后评价指标均有较大进展，特别是分子生物学方面进展进一步揭示了TBI继发损伤过程。无论是血管源性脑水肿还是细胞毒性脑水肿都离不开炎症介质的参与〔5〕，其中NE作为创伤后的重要炎性介质，广泛地参与到创伤后继发的病理生理改变过程中。

本研究采用液压打击方法制作TBI大鼠模型是一种成熟的TBI模型，操作过程相对比较简单，模型稳定，已经广泛的运用于TBI的各种实验研究中。EB是一种经典的BBB示踪剂，进入血液后与血清蛋白结合形成EB-白蛋白复合物。正常情况下，这种复合物不能通过BBB，但在颅脑创伤后存在BBB完整性的破坏，EB-白蛋白复合物可以通过破坏的BBB进入脑组织间隙，而EB的渗出量与BBB的破坏程度呈正比。本实验可以反映BBB破坏程度，间接地反映BBB的通透性〔6〕。NE与BBB屏障通透性变化的同步性说明了NE含量的增加，可能是BBB通透性增高的原因之一。NE是由类溶酶体结构的嗜苯胺蓝颗粒释放的一种丝氨酸蛋白水解酶，NE可以分解周围蛋白质和破坏组织结构，可以降解弹性蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白等，纤维连接蛋白受损，则血管通透性增高〔7〕。研究人员通过动物实验发现，外源性NE能够破坏或分解表面活性物质的主要成分表面活性蛋白SP-A、SP-B、SP-C，导致肺泡表面张力增加，降低肺组织顺应性，促进血浆渗漏，引起肺血管内皮和肺泡上皮通透性增高〔8〕。BBB通透性增高是导致创伤性脑水肿的重要原因。本研究发现TBI大鼠脑组织含水率的变化与NE含量和BBB通透性增高并不完全同步，NE含量增加和BBB通透性增高的高峰期出现在创伤后48 h，而含水率的最高峰发生在72 h，这种高峰的延迟说明TBI首先引起NE等炎症介质的含量变化，通常影响BBB通透性，进一步加重了血管性脑水肿，而NE等炎性介质也可能进一步加重细胞毒性水肿的程度。

本实验结果提示:实验性TBI大鼠脑组织内NE含量的升高与脑组织水肿密切相关，NE增加可能是TBI后早期引起BBB通透性增加、血管源性脑水肿形成的重要原因之一。在TBI发生的过程中，脑组织创伤使脑组织产生炎症反应，大量中性粒细胞浸润，激活的中性粒细胞释放大量的NE，从而降解弹性蛋白、蛋白多糖和胶原，导致组织、细胞和血管基底膜损伤，因此推测NE是引起血管损伤的重要因素之一，是TBI继发性脑水肿形成的重要原因，这一发现可能将为治疗TBI后脑水肿开辟一新的途径。

1 Shimakura A，Kamanaka Y，Ikeda Y，et al.Neutrophil elastase inhibition reduces cerebral ischemic damage in the middle cerebral artery occlusion〔J〕.Brain Res，2000;858(1):55-60.

2 胡 月，董 志，晏 飞.西维来司钠对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(6):1459-62.

3 Thompson HJ.Lateral fluid percussion brain injury:a 15-year review and evaluation〔J〕.Neurotrauma，2005;22(10):42-75.

4 Marmarou A.Pathophysiology of traumatic brain edema:current concepts〔J〕.Acta Neurochir Suppl，2003;86:7-10.

5 Donkin JJ，Vink R.Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury:therapeutic developments〔J〕.Curr Opin Neurol，2010;23(3):293-9.

6 胡 俊，丁仕义，黎海涛，血脑屏障开放的检测方法〔J〕.重庆医学杂志，2003;32(12):1774-6.

7 Carden D，Xiao F，Moak C，et al.Neutrophil elastase promotes lung microvascular injury and proteolysis of endothelial cadherins〔J〕.Am J Physiol，1998;275:H385-92.

8 Hagio T，Matsumoto S，Nakao S，et al.Sivelestat，a specific neutrophil elastase inhibitor，prevented phorbolmyristate acetate-induced acute lung injury in conscious rabbits〔J〕.Pulmon Pharmacol Thera p，2005;18:285-91.