低强度脉冲超声波辐照与泡沫TiC/Ti对犬节段性骨缺修复的促进作用

胡 莹，刘笑涵，王靖宇，吴 琳，高 勇，张劲松

(1.中国医科大学口腔医学院修复科，辽宁省口腔医学研究所，沈阳 辽宁 110002;2.中国科学院金属研究所，沈阳 辽宁 110016)

对肿瘤、炎症或外伤等原因造成的复杂外形、长段承重骨缺损的修复一直是临床工作的难题。低强度脉冲超声波(low-intensity pulsed ultrasound stimulation，LIPUS)是一种加速骨修复，促进骨愈合的非侵入性物理疗法。基于临床实验的研究结果，低强度脉冲疗法在骨科领域逐渐实现了商业化，美国食物和药品管理部门于1994年和2000年相继批准了在临床上应用低强度超声波治疗仪治疗新鲜骨折和骨不连［1，2］。国内外学者关于 LIPUS对骨折愈合作用机理的研究已逐步深入到分子生物学水平，并认为频率1.5 MHz、强度 30 mW/cm2、脉冲宽度 200 μs、脉冲周期 1 kHz、20 min/次、1 次 /d 的超声参数治疗效果最佳［3］。

本实验利用TiC/Ti泡沫材料修复beagle犬胫骨节段性骨缺损，LIPUS辐照患区，利用影像学研究手段及骨密度的测定，分析LIPUS辐照对节段性骨缺损修复的影响，为评估将LIPUS作为一种辅助治疗手段应用到节段性骨缺损的可行性提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 植入材料:TiC/Ti泡沫材料，孔径1 mm，孔隙率为80%。规格:直径12 mm长20 mm。超声波清洗3次，高温高压灭菌(134℃，0.21 MPa)。

1.1.2 内固定器 依据左侧胫骨中段解剖特征制成带翼和不带翼固定板两种，配套自攻钉、固定钉及其螺帽。带翼固定板及其对侧不带翼固定板、自攻钉为低弹性模量钛铌锆锡合金(简称Ti-2448钛合金)材料，固定钉及其螺帽为316L不锈钢材料。由中国科学院金属研究所制作提供。超声波清洗3次，高温高压灭菌(134℃，0.21 MPa)。

1.2 实验动物及实验环境

选用6只健康成年 beagle犬，雌性，体重7～8 kg，所用动物均独立喂养，观察1周后将健康动物用于实验。分为超声组及实验组两组，每组3只。动物合格证号为:SYXK(辽)2008-0005。

1.3 植入方法及术后超声波辐照

各组犬均以速眠新2号按0.06 mL/kg肌内注射麻醉后，绑定、备皮、消毒、铺巾，2%利多卡因局部浸润麻醉，于胫骨中段沿骨长轴切开皮肤深达皮下，钝性分离肌肉和骨膜至骨面，充分暴露术野，嵌入事先准备好的自制模板，无菌生理盐水冷却下利用裂钻在预定骨截出部位的近远中各钻2个孔，4个孔沿胫骨长轴排列在一条直线上，模板控制孔道的方向相互平行。带翼固定板放入，按植入材料大小截骨制备成全层骨缺损模型，注意保护腓骨和周围血管肌肉，TiC/Ti材料植入，安放对侧固定板，旋紧螺钉，确保材料与骨断端间接触稳定。用0.9%的生理盐水及8万单位的庆大霉素冲洗术区。分层缝合，关闭切口，消毒皮肤。术后当日起80万单位/d青霉素肌肉注射抗菌，连续3 d。超声波辐照过程:术后第3天开始进行术区的超声波辐照，超声波治疗仪由重庆海扶医疗公司提供。超声参数:频率1.5 MHz、强度 30 mW/cm2、脉冲宽度 200 μs、脉冲周期 1 kHz、20 min/次、1 次/d，对照组为不开功率源的假辐照。

1.4 X射线观察及分析

分别于术后当天、术后4周、8周垂直术区平面摄胫骨缺损部位X线侧位片，通过骨断端的模糊程度，内外骨痂密度，骨痂生成量对 X线结果进行评定。

1.5 骨密度测定方法

使用Image-Pro Plus 6.0软件对每张X线片新生骨平均密度及自身宿主骨平均密度进行测量，利用下面公式计算新生骨痂组织的骨密度值。

新生骨痂组织的骨密度值=新生骨平均密度值 /宿主骨平均密度值

1.6 统计学方法

利用SPSS 13.0软件采用t检验的方法对数据进行处理。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X射线观察结果

4周时超声组骨痂早期成熟度优于对照组，表现在材料周围有骨痂影从两端向中央形成且密度较高，可见相对完整的骨干;对照组仅见骨痂影密度低，还可见部分骨痂缺如。8周时超声组新生骨痂面积优于对照组，超声组骨干形成相对稳定，对照组对位对线良好，骨断端骨质未闭合，在骨断端两侧看到少量的骨痂，愈合较差(图1)。

(:材料周围新生骨痂部分)。图1 X线观察超声组及对照组术后、4周、8周材料周围骨愈合情况(:New bone callus section around the material).Fig.1 Postoperative X-ray film analysis of the bone formation around the implanted material at 4 and 8 weaks

2.2 骨密度测定结果

4周时超声组新生骨痂组织骨密度高于对照组新生骨痂组织骨密度，P＜0.05存在统计学差异;8周时两组间差异无统计学意义 (表1)。

表1 超声组及对照组新生骨痂组织骨密度测定比较(mg/cm2，±s)Tab.1 Comparison of bone mineral density rate in the two groups(mg/cm2，±s)

表1 超声组及对照组新生骨痂组织骨密度测定比较(mg/cm2，±s)Tab.1 Comparison of bone mineral density rate in the two groups(mg/cm2，±s)

注:与对照组相比，aP＜0.05。Note:ap＜0.05，compared with the control group.

超声组 Ultrasound treatment 0.97±0.02a 0.99±0.01对照组Control 0.91±0.02 0.98±0.02

3 讨论

LIPUS是一种非侵入性机械能，经皮传递后可在生物器官内产生高频率声波。LIPUS促进骨愈合的可能作用机制可以概括为三个方面。首先，LIPUS可直接影响参与骨愈合过程的一系列细胞信号改变，其产生的剪切力或血流的改变直接作用于细胞膜上的第二信号系统，膜通道开放，钙离子内流增加，具有提高骨密度的潜在效应［4－6］。其次，LIPUS能促进血管内皮生长因子-A(VEGF-A)mRNA水平增加，VEGF是血管生成的重要调节因子。LIPUS还可刺激肥大软骨细胞增殖，增强软骨外基质(II型胶原和糖胺聚糖等)的合成及新生骨质的成熟程度，促进软骨内化骨的早期出现［7－9］。因此，可以推测本实验模型经 LIPUS辐照，各种骨效应细胞活性提高、骨缺损部位血管分布增多、软骨外基质合成增强，加速新骨的形成和矿化。本实验结果显示，超声组骨痂的成熟先于对照组;4周时超声组新生骨痂组织骨密度高于对照组，而8周时超声组与对照组相比骨密度无统计学差异，提示LIPUS对骨形成和矿化的影响在早期。这个结果与Pilla等人的研究结果相一致，Pilla等［10］经过多次实验总结出LIPUS作用于炎症期和骨痂形成期，在塑性期未发生作用。

另外，LIPUS还可以通过加快骨重建，改善骨痂结构，增强骨的生物力学性能，发挥促进骨愈合的作用［11.12］。本课题组将在本实验的基础上，通过组织形态学、生物力学及影像学检测，进一步评价LIPUS对节段性骨缺损修复的影响。

由于外伤、肿瘤、感染等原因造成的节段性骨缺损达到一定长度后即不能形成骨性愈合，因此成为骨科修复领域一大棘手问题，有学者通过建立动物模型对其治疗方法进行探讨［13］。近年来，随着生物技术与临床实践相结合的日益深入，各种生物材料在临床上已广泛应用于修复骨组织缺损［14］。本课题组前期实验已经证实泡沫 TiC/Ti具有良好的生物安全性、骨结合能力、骨传导性及良好的机械性能，具备成为新一代大段骨缺损修复材料的可能性［15］。本实验目的在于通过联合应用 LIPUS与泡沫TiC/Ti修复beagle犬胫骨节段性骨缺损，促进新生骨组织的形成，缩短骨愈合时间。LIPUS虽然已被批准应用于临床骨折及骨不连的治疗，但其对节段性骨缺损的治疗作用仍处于初期探索阶段，实验室中建立的骨缺损模型多为小范围的缺损，如LIPUS对Beagle犬前磨牙牙周骨6 mm深的骨缺损和大鼠颅骨直径2.7 mm的骨缺损的加速修复［16］。

综上，本实验通过TiC/Ti泡沫材料修复 beagle犬胫骨节段性骨缺损，LIPUS辐照患区，其影像学结果证实联合应用低强度脉冲超声波辐照与人工骨材料修复可提高新骨形成速度及骨组织密度，缩短节段性骨缺损的骨愈合时间。但是本实验仍存在许多尚待研究的问题:如LIPUS在传播中由于长骨周围覆盖的软组织、植入材料及其内固定器金属材料的吸收作用而衰减［17］，因此，LIPUS具体治疗参数的选择及加载周期的制定等方面仍需要实验验证。

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［2］US Food and Drug Administration(FDA):Exogen 2000，3000，or Sonic Accelerated Fracture Healing System (SAFHS):Summary of Safety and Effectiveness.Premarket Appreval P900009/Supplement 6.Exogen，Inc，Rockville，MD，US Food and Drug Adminstration，February 22，2000.

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