小鼠组蛋白去乙酰化酶2多肽抗血清的制备

朱 华，梁 良，盛树力，黄 澜，徐艳峰，秦 川

(卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

阿尔茨海默病(AD)是痴呆的主要类型，临床表现为记忆和认知的退化，其主要病理特征是胞内出现神经纤维缠结(NFT)和胞外淀粉样蛋白沉淀形成老年斑(SP)。AD的致病机理仍不明确，目前比较流行的学说是 β淀粉样蛋白级联假说［1］。表观遗传学修饰为研究AD开辟了新的途径，其中最受关注的是 DNA 甲基化和组蛋白修饰［2，3］，组蛋白酰基化状态由组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)催化，组蛋白酰基化修饰在学习和记忆功能中的作用如何?在进行相关研究时无论是在细胞水平还是在整体水平，都需要大量HDAC的抗体来进行检测。本文采用合成肽制备HDAC2抗血清，检测了其特异性和在AD小鼠脑组织中的应用效果，报告如下。

1 材料和方法

1.1 多肽片段的挑选、合成

根据 Genbank中小鼠 HDAC2的氨基酸序列(Genbank accession number:BC031055)，挑选 392～411位氨基酸位多肽为抗原 (N'-EDSGDEDGREDPDK RISIRY-C')(图1)。多肽片段由北京中科亚光生物科技有限公司合成。纯度99%。

1.2 多肽片段与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)的偶联

称取12 mg多肽，用0.5 mL pH 7.4的 PBS溶解，缓慢加入10 mL KLH(Sigma，货号H8283)中，量取事先配好的联苯胺-亚硝酸盐混合物350 mL冰浴冷却下缓慢滴加上述KLH-多肽混合物中，冰浴反应1.5 h时。置入透析袋，PEG 6000浓缩至 2 mL。Sephadex G-200经水饱和后装柱，0.05 mol/L磷酸缓冲液 (pH 7.2)平衡，缓慢上样，在280 nm监测下收集第一个峰。

图1 HDAC2氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of histone deacetylase 2

1.3 免疫动物

实验用新西兰大白兔1只，购自中国药品生物制品检定所动物中心【SCXK(京)11-00-0010】，体重约3 kg。实验在本所进行【SYXK(京)2010—0030】。取1 mL偶联好的多肽加等量弗氏完全佐剂(Sigma，货号 F5506)，充分乳化后在动物背部皮内多点注射，每只2 mL。以后每隔3周用弗氏不完全佐剂(Sigma，货号056K8908)与多肽乳化后免疫动物，共3次。第3次免疫后10 d，动脉放血，分离血清，－80℃保存。

1.4 ELISA检测抗体效价

第2次免疫后10 d，耳缘静脉取血，3 000 r/min 10 min离心分离血清检测抗体效价。以2 μg/mL的多肽为抗原4℃过夜包被酶标板。第2天用PBS冲洗，分别加入免疫血清(一抗)和酶标羊抗兔IgG(北京鼎国生物技术公司，货号EIA-0011)。具体方法见文献［4］，显色后在 Bio-Rad 3350自动酶标仪上读取450 nm光密度值。

1.5 Western-blot

按照文献［5］的方法从小鼠脑组织中提取HDAC2蛋白，将样品浓度调整至1.5 μg/μL。与同浓度的偶联多肽进行10%SDS-PAGE后转至硝酸纤维素膜(NC膜)。把NC膜放人封闭液中，摇床上温育l h。TBS漂洗后，分别转移到1:1000稀释的市售 HDAC2抗体(abcam公司，货号 ab51832)，室温下振荡孵育2 h，TBS-T漂洗4次，每次10 min;加入1:10 000 TBS-T稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗溶液，室温下振荡孵育1 h;TBS-T漂洗4次，每次10 min;加入酶反应底物TMB，反应终止后曝光、显影、定影、照相。

1.6 免疫组化

App/PS1双转基因小鼠脑组织常规脱蜡至水进行SP法免疫组化染色:3%过氧化氢溶液作用15 min，以消除内源性过氧化物酶;用pH 6.0枸橼酸微波修复10 min，加正常山羊血清室温孵育30 min，甩去多余血清，滴加免疫血清做为一抗(稀释度1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600)。阴性对照用0.01 mmol/L的 PBS，4℃过夜，滴加生物素化二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG聚合物，北京中杉金桥，货号 PV-9002)，37℃ 30 min，DAB 显色(北京中杉金桥，货号 ZLI-0001)，(5～10)min后 PBS终止，苏木素复染，中性树胶封片。

2 结果

2.1 抗体效价

为了鉴定所制备的动物免疫血清的效价和是否具有识别小鼠去组蛋白乙酰化酶的能力，我们用ELISA方法，以合成的小鼠HDAC2多肽为抗原包被酶标板，抗体稀释到1∶4 000时的吸光值远高于对照抗原BSA的吸光值(样品孔与对照L吸光值之比高于3，P/N≥3)，表明抗体与小鼠 HDAC2的免疫反应为阳性，而且所得到的抗体是特异性的抗体(表1)。

表1 不同稀释度的HDAC2多肽抗体的ELISA结果Tab.1 ELISA results of HDAC2 antibody at different dilutions

2.2 Western blot结果

为了进一步确定所制备的免疫血清与HDAC2免疫反应的特异性，我们用合成的多肽抗原与免疫血清进行Western blot，并与市售抗体进行比较。图2显示，合成多肽可以同不同稀释度的免疫血清形成反应显示带(第 1、2、3、4 行)，(第 1 行)。这些结果提示我们所制备的免疫血清可以识别小鼠的HDAC2。

1.1∶1 000稀释的HDAC2合成多肽与抗血清反应。2.1∶2 000稀释的HDAC2合成多肽与抗血清反应。3.4 APP/PS1小鼠脑组织与抗血清反应。5.1∶1 000稀释的HDAC2多肽与市售抗体反应。6.APP/PS1小鼠脑组织与市售抗体反应。图2 小鼠HDAC2多肽抗血清、市售抗体与合成多肽及小鼠脑组织的Western blot结果Lane 1:Synthesized HDAC2 reacts with antisera in 1∶1 000.Lane 2:Synthesized HDAC2 reacts with antisera in 1∶2 000.Lane 3＆4:APP/PS1 mice brain tissue reacts with the antisera.Lane5:Synthesized HDAC2 reacts with the commercial monoclonal antibody.Lane6:APP/PS1 mouse brain tissues react with commercial monoclonal antibody.Fig.2 Western blot assay of the antiserum，HDAC2 antibody with the synthesized HDAC2 peptide in the APP/PS1 mice brain tissue(Protein standards are shown on the left).

2.3 免疫组化结果

免疫血清在 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800 四个稀释度均能与APP/PS1小鼠脑组织中的HDAC2反应:大脑皮层神经元细胞胞质阳性着色，神经胶质细胞及细胞间质内未见阳性着色。海马区神经元细胞胞质阳性着色，间质内未见阳性着色。1∶1 600及阴性对照未见阳性颗粒。随着稀释度的增高，染色的背景降低(图3见封二)。

3 讨论

组蛋白去乙酰化酶2是Siauins家族中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖的去乙酰化酶之一。其生理功能是除去乙酰基。改变蛋白质的性能，从而调节细胞的生理活动。组蛋白酰基化状态由组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶催化，越来越多的证据显示组蛋白酰基化修饰在学习和记忆功能中起了重要作用［6，7］研究发现 HDAC不仅具有神经保护的作用，同时能增强突触可塑性和学习记忆能力，因而HDAC作为其催化靶点越来越引起重视。研究组蛋白去乙酰化酶在AD的作用机制，为研究AD提供了新的靶点。组蛋白去乙酰化酶作为主要靶蛋白在其中所起作用为:(1)改变组蛋白酰基化水平进而影响与记忆相关基因的表达;(2)参与了AD的发病过程。HDAC2作为组蛋白去乙酰化酶家族成员之一，在AD中的作用越来越受到重视。研究发现在AD鼠中出现组蛋白酰基化水平异常［8，9］，而组蛋白去乙酰化酶抑制剂能改善 AD鼠的学习和记忆能力并提高组蛋白酰基化。App/PS1双转基因小鼠是目前公认的研究AD的最佳模型，此模型鼠在6个月时大脑皮质即出现老年斑［10］。且出现神经溃变和突触丢失等形态学变化并伴有学习记忆能力下降等功能障碍。我们的多肽血清可以特异识别App/PS1双转基因小鼠脑内的HDAC2，效价达到1:800。可应用于神经退行性疾病、心脑血管疾病、肿瘤等 HDAC2的体内、体外研究。

要制备出理想的抗体，首先要有较纯的、抗原性良好的免疫原;其次是选择一个合适的免疫途径。小鼠的HDAC2序列含有478个氨基酸，其392-411位氨基酸位因亲水性较高，没有易发生折叠的半胱氨酸，末端不含影响免疫原性的芳香族氨基酸等优势被本实验选为多肽抗原。化学合成的多肽作为抗原没有免疫原性，需要偶联到一个具有免疫原性的载体蛋白上，将偶联物作为抗原免疫动物。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、卵蛋白(OVA)和钥孔戚血蓝蛋白(KLH)，其中钥孔戚血蓝蛋白来自于软体动物，其序列与哺乳动物同源性很小，而且该蛋白分子量较大，抗原性非常强，是目前多肽抗体制备中应用最为广泛的载体蛋白。实验结果显示，KLH偶联的HDAC2多肽血清可与免疫原特异性反应，并与异常表达HDAC2组织发生反应，说明多肽段的选择、偶联策略是正确的，可以应用于抗血清的大量制备。

我们制备抗多肽血清未经过纯化，除多肽抗体成分外还含有其它杂蛋白如血清中非抗体成分白蛋白、免疫多肽无关的抗体成分等。这可能也是Western blot结果中在43～55Kd间出现杂带的原因。推测低稀释度的免疫组化染色背景较重也与此相关，可通过提高抗体稀释度的方法避免。

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