薯莨提取物止血效果及化学成分的初步研究

安静波，郭 健，宋文东，李秋萍，纪丽丽，仝绍伟，韩丝银

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088；2.广东海洋大学理学院，广东湛江524088；3.浙江海洋学院石化与能源工程学院，浙江舟山316000；4.东华大学环境科学与工程学院，上海200051）

薯莨（Dioscorea cirrhosa Lour）是薯蓣科薯蓣属的一种藤本植物，药用其块茎[1]。味微苦、涩，性微寒，具有清热解毒，止血活血，收敛止痒，行气止痛，活血祛瘀，抗菌等功能[2]。长期以来其生长处于自生自灭的野生状态，目前主要用于提取其中的色素作为天然染料[3]，民间将其作为草药主要用于止血等[4]，对其药用有效成分的研究很少，并且有效成分尚不明确，而薯莨中化学成分的研究也多集中于其色素成分单宁方面，使得薯莨的综合利用也受到了极大的局限。我国中药止血药应用历史悠久，研究中发现了大量的止血活性成分几乎囊括了各类化学成分，主要有氨基酸类、生物碱类、萜类、甾体、酚类、黄酮类、醌类化合物、苯丙素类、脂类等[5-14]。本文对薯莨乙醇提取物的止血效果进行了研究，并初步鉴定了其中的化学成分，以期利用薯莨的乙醇提取物生产止血药物，提高薯莨的利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

薯莨块茎 采自广东省佛山市顺德区大良；小白鼠 昆明种小鼠，雌雄兼用，体重20 ～25g，由广东医学院提供。

JM-C203T型分析天平 余姚纪铭称重校验设备有限公司；SAM-1560型粉碎机 台州市黄岩迪胜塑料厂；EV201型旋转蒸发仪 北京莱伯泰科仪器有限公司；GZX-9070MBE型数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DH-1831型血气分析仪 南京南分医用实验仪器有限责任公司；ZG12020型云南白药 云南白药集团股份有限公司；乙醇 分析纯，广东光华科技股份有限公司；其他实验所用试剂 均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 薯莨乙醇提取物的制备 以80%的乙醇水溶液为溶剂，料液比为2∶1，于60℃的热水中水浴浸提2h，放暗处静置12h，过滤、旋转蒸发浓缩，50℃鼓风干燥。

1.2.2 给药方式 实验共分四个剂量组，即空白组给予生理盐水灌胃、高剂量（0.66g/kg）、低剂量组（0.33g/kg），云南白药组（0.40g/kg）。每个剂量组10只小鼠，雌雄分配均匀，每天灌胃1次，连续给药10d。

1.2.3 小鼠止血指标的测定

1.2.3.1 小鼠出血时间的测定[15]末次给药40min后，剪断鼠尾远端1/3段，立即用秒表计时，用滤纸每隔30s吸一次，至无血痕为止，此时的时间即为出血时间。1.2.3.2 小鼠凝血时间的确定[15]末次给药40min后，用眼科弯镊迅速摘去一侧眼球即有血液流出，于载玻片上滴1滴血（弃掉第1 ～2滴），血滴直径约5mm，立即记时，每隔30s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动1次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止，所历时间即为凝血时间。

1.2.3.3 小鼠血小板数量的检测 在小鼠眼球后静脉丛取血后，采用摘除眼球法取血放入肝素钠采血管，用全自动血细胞分析仪检测血小板数量。

1.2.4 薯莨提取物化学成分的鉴定[16-17]

1.2.4.1 黄酮类颜色反应 方法a：（三氯化铝反应）将提取液滴在滤纸上，喷洒1%三氯化铝的乙醇溶液，干燥后，由黄酮类化合物产生的黄色斑点于紫外灯下显荧光；方法b：（铅盐反应）1%醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液，碱式醋酸铅反应更强，可生成黄-红色沉淀。

1.2.4.2 蒽醌类颜色反应 方法a：（碱液反应）取提取液1mL置于试管中，加入10%NaOH，观察颜色变化。溶液呈现红色或者紫红色，加入双氧水后红色不褪，调酸性后，红色褪去。羟基蒽醌类遇碱显红-紫红色，这是蒽醌类一个很重要的鉴别反应；方法b：（醋酸镁反应）取提取液1mL，加入5%醋酸镁的醇溶液，反应生成橙红、紫红、蓝紫色配位化合物，表示有羟基蒽醌。

1.2.4.3 多酚类、单宁的颜色反应 方法a：（香草醛-盐酸反应）取提取液点于滤纸片上，干后，喷雾或滴加香草醛-盐酸试剂，立即呈现红色斑点，说明可能含有酚类或单宁；方法b：（三氯化铁反应）样品溶液加醋酸酸化后，滴加1%三氯化铁试剂。呈现蓝、墨绿或蓝紫色，证明可能含有酚类或单宁（鞣质）。含有没食子酸的单宁呈蓝色，含有儿茶酚的单宁呈绿色。

1.2.4.4 皂甙颜色反应 方法a：（泡沫反应）取提取液2mL置于试管内，激烈振摇3min，如果产生持续性泡沫，可能含有皂甙。一般来说，典型的皂甙反应，产生的泡沫很显著，在试管内能持续10min以上，加热或加入乙醇，泡沫都不会明显减少；方法b：（醋酐-浓硫酸反应）取提取液2mL，将溶剂蒸发掉，残渣中加入0.5mL的冰醋酸溶解，再滴加醋酐-浓硫酸试剂3 ～5滴，如果呈紫红色，并且溶液上层逐渐变绿，表明含甾体皂甙或三萜皂甙。甾体皂甙显绿色，三萜皂甙显红紫色或蓝色。

1.2.4.5 三萜、甾醇类颜色反应 方法a：（醋酐-浓硫酸反应）取提取液2mL，将溶剂蒸发掉，残渣中加入0.5mL的冰醋酸溶解，再滴加醋酐-浓硫酸试剂3 ～5滴，如果呈紫红色，并且溶液上层逐渐变绿，表明含甾体皂甙或三萜皂甙。甾体皂甙显绿色，三萜皂甙显红紫色或蓝色；方法b：（氯仿-浓硫酸反应）样品溶于氯仿，加入浓硫酸后，在氯仿层呈现红色或蓝色，硫酸层有绿色荧光出现。

1.2.4.6 有机酸类颜色反应 方法a：pH试纸检查；方法b：（溴酚蓝反应）具体分析方法如下：提取液滴于滤纸片上，喷洒0.1%溴酚蓝溶液立即在蓝色的背景上显现黄色的斑点。若反应不明显，再喷洒氨水，暴露在盐酸气体中，背景逐渐由蓝色变黄色，而含有有机酸（盐）的斑点仍为蓝色。

1.2.4.7 生物碱类颜色反应 方法a：（碘-碘化钾反应）取适量提取液加盐酸至酸性，加碘-碘化钾鉴别试剂后，立即有浅棕或暗棕色沉淀出现；方法b：（硅钨酸反应）取适量提取液加盐酸至酸性，加硅钨酸鉴别试剂后，立即有浅黄或灰白色沉淀出现。

1.2.4.8 蛋白类颜色反应 方法a：（加热沉淀反应）取提取液1mL置于试管中，加热至沸或加5%盐酸，如发生混浊或有沉淀表明含有水溶性蛋白质；方法b：（茚三酮反应）取检品的水溶液1mL，加入0.1%茚三酮试液2 ～3滴，混匀后加热煮沸1 ～3min，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝色。

2 结果与分析

2.1 薯莨乙醇提取物对小鼠出血时间（BT）的影响

如表1所示，给药10d后的云南白药组和薯莨高剂量组的BT较给药前和对照组均有极明显的缩短（p＜0.01），薯莨低剂量组的BT也明显小于给药前和对照组（p＜0.05）；薯莨高剂量组和云南白药组的BT明显小于薯莨低剂量组（p＜0.01）。由此可见，薯莨的乙醇提取物具有良好的止血作用。

表1 薯莨提取物对小鼠出血时间（BT）的影响（±s）Table 1 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on bleeding time in mice（±s）

表1 薯莨提取物对小鼠出血时间（BT）的影响（±s）Table 1 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on bleeding time in mice（±s）

注：△与正常组相比较p<0.05，△△与正常组相比较p<0.01；▲与薯莨低剂量组相比较p<0.05，▲▲与薯莨低剂量组相比较p<0.01；＊与给药前相比较p<0.05，＊＊与给药前相比较p<0.01；表2、表3同。

组别 BT（s）给药前 给药后对照组 348.39±12.44 347.65±13.94云南白药组 350.7±11.47 290.71±10.38△△▲▲＊＊低剂量组 349.5±14.83 333.28±9.53△＊高剂量组 349.57±13.05 152.26±11.47△△▲▲＊＊

2.2 薯莨乙醇提取物对小鼠凝血时间（CT）的影响

如表2所示，给药10d后的薯莨高剂量组的CT较给药前和对照组均有极明显的缩短（p＜0.01），云南白药组和薯莨低剂量组的CT也明显小于给药前和对照组（p＜0.05）；薯莨高剂量组的CT明显小于薯莨低剂量组（p＜0.01），由此可见薯莨提取物的低剂量组和高剂量组都具有良好的凝血作用。

表2 薯莨提取物对小鼠凝血时间（CT）的影响（±s）Table 2 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on clotting time in mice（±s）

表2 薯莨提取物对小鼠凝血时间（CT）的影响（±s）Table 2 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on clotting time in mice（±s）

组别 CT（s）给药前 给药后对照组 97.42±11.27 96.83±11.57云南白药组 96.32±12.05 84.43±11.31△＊低剂量组 96.23±10.77 82.44±11.91△＊高剂量组 95.70±9.58 45.05±10.80△△▲▲＊＊

2.3 薯莨乙醇提取物对小鼠血小板数量（Plt）的影响

如表3所示，给药10d后的薯莨高剂量组和云南白药组的Plt较给药前和对照组均有极明显的提高（p＜0.01），薯莨低剂量组的Plt也明显小于给药前和对照组（p＜0.05）；薯莨高剂量组和云南白药组的Plt较薯莨低剂量组也有极明显的提高（p＜0.01）。发生止血和凝血效应的机制有多种，但大都与血小板的作用有关系，血小板通过释放血管收缩物质、血小板粘聚成团堵塞损伤的血管和促进凝血从而有助于暂时止血。由表3可以看出，薯莨提取物可以明显提高小鼠血小板的数量，从而达到止血的效果。

表3 薯莨提取物对小鼠血小板数量（Plt）的影响（±s）Table 3 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on platelet count in mice（±s）

表3 薯莨提取物对小鼠血小板数量（Plt）的影响（±s）Table 3 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on platelet count in mice（±s）

组别Plt（109/L）给药前 给药后对照组 250.29±24.01 251.89±27.58云南白药组 251.18±25.05 564.79±22.12△△▲▲＊＊低剂量组 247.09±25.43 276.58±20.79△＊高剂量组 249.59±26.35 921.57±21.73△△▲▲＊＊

2.4 薯莨乙醇提取物的成分鉴定结果

我国中药止血药应用历史悠久，目前已发现的止血活性成分主要有氨基酸类、生物碱类、萜类和甾体、酚类、黄酮类、醌类化合物、苯丙素类、脂类等，本实验对薯莨的乙醇提取液的成分鉴别，可以推断薯莨的乙醇提取液中除了薯莨的主要成分酚类和甙类，还可能含有黄酮、蒽醌、三萜、甾醇、有机酸等止血成分，从而综合的提高其止血功能。

3 结论与讨论

目前，国内外关于薯莨的各方面的研究尚处于空白或萌芽阶段，其临床应用受到了极大的局限，这对于薯莨的综合利用十分不利。因此，挖掘这一宝贵资源的药用潜力，深入研究薯莨的化学成分和药理活性，发现其发挥药理作用的药效作用部位及其作用机制，开发出疗效质量稳定的新药，实现中药现代化非常必要。

本实验通过对薯莨乙醇提取物的止血效果进行了初步的探究，并对其起止血作用的化学成分进行了初步的鉴定。结果证明薯莨的乙醇提取物具有良好的止血和凝血效果，其中主要鞣质及甙类是薯莨的主要化学成分，鞣质即植物单宁，又称植物多酚可使创伤后渗出物中蛋白质凝固，形成痂膜，致减少分泌和防止感染，并能使创面的微血管收缩，有局部止血作用，可外用于创伤、灼伤。用极细粉敷于外伤出血处，能当即止血，因而具有快速高效特点，可用于应急救治药物[18]。本实验证明薯莨的乙醇提取液的止血成分除了鞣质及甙类，还有黄酮、蒽醌、三萜、甾醇、有机酸等止血成分，从而综合提高其止血功能。血小板的主要功能是凝血和止血，修补破损的血管。当人体受伤流血时，血小板受到损伤部位激活因素刺激出现血小板的聚集，成为血小板凝块，起到初级止血作用，血小板和血液中的其他凝血物质——钙离子和凝血酶等，在破损的血管壁上聚集成团，形成血栓，堵塞破损的伤口和血管，血小板还能释放肾上腺素，引起血管收缩，促进止血。薯莨的乙醇提取物能有效提高Plt，从而缩短出血时间和凝血时间。实验表明薯莨的乙醇提取物具有良好的止血效果，高剂量组的出血时间、凝血时间和血小板数量与正常对照组和注射前相比具有极明显的缩短和增加；低剂量组的出血时间、凝血时间和血小板数量与正常对照组和注射前相比也具有明显的缩短和增加。薯莨具有良好的止血的作用，因此薯莨的乙醇提取物可用于止血药物的制备，一方面可以提高薯莨的利用价值，对薯莨资源的合理利用具有一定的意义，另一方面也为新的有效止血药物提供新的资源。但薯莨提取物是否还能通过加强血管收缩、间接刺激子宫收缩、提高凝血因子数量等方面来促进止血和凝血的作用，还有待于进一步的研究。

表4 薯莨乙醇提取物的成分鉴定结果Table 4 The active ingredients of Dioscorea cirrhosa Lour ethanol extract

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