油菜蜂花粉中皂苷化学成分的研究

戴志乔，徐德平

江南大学食品学院，无锡214122

油菜花粉(pollen)是十字花科植物油菜(Brassica campestris L)的有性生殖的雄性配子体。花粉浓缩了植株的营养精华，被人们誉为“最完美的食物”。蜂花粉是蜜蜂采集的花粉加入花蜜和唾液形成的粒状物，因此，又被人们誉为“微型营养库”［1］。具有抗肿瘤［2］、改善记忆力［3］、防治脑心血管疾病、调节神经系统、促进睡眠［4］、保肝护肝、防治前列腺疾病、调节肠胃功能等功能。

有关油菜蜂花粉化学成分的研究很多，主要集中在多糖、黄酮等，而对其中的皂苷尚未有研究报道。本文对油菜蜂花粉中的皂苷进行了初步研究，分离到三个齐墩果烷型皂苷，这在油菜蜂花粉中还是首次报道。

1 材料与仪器

油菜蜂花粉:购于南京老山药业有限公司;乙醇、正丁醇、硫酸、茴香醛、冰乙酸、二甲亚砜均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供;GF254硅胶板:山东烟台芝罘化工厂生产;AB-8型大孔吸附树脂(100 mm ×1500 mm):天津南开大学化学工厂生产;ODS填料:Nacalai Tosoh Inc;MCI填料:Mitsubishi Chemical Corporation。

DFY-600摇摆式高速中药粉碎机:温岭市林大机械有限公司;CQ-005型萃取罐:常州市特威电气自动化系统有限公司;中压输液泵:天津科器高新技术公司;R-1002型旋转蒸发仪:上海申顺生物科技有限公司;核磁共振仪Avance 500 MHz:Buker公司。

2 提取与分离

2．1 油菜蜂花粉皂苷的提取

将油菜蜂花粉粉碎过60目筛，称取15 kg，分次缓慢加入沸水浴中，煮沸30 min，充分灭酶后，浓缩至干。将灭酶后的花粉加入100 L萃取罐中，以料液比1∶5(w/v)加入体积分数为80%乙醇溶液，60℃提取2 h，过滤出清液，将滤渣再按上述方法重复提取二次，合并清液减压浓缩至无乙醇时止。加入适量的水，用石油醚脱脂后，收集水相，减压蒸干，待用。

2．2 油菜蜂花粉皂苷的粗分

将上述脱脂粗品上样大孔树脂［5］(100 mm ×1500 mm，树脂为型号为AB-8)，调节层析柱流速约20 mL/min，分别用体积分数为30%、40%、50%、60%的乙醇梯度洗脱，TLC法跟踪检测洗脱液，将Rf值和显色反应一致的洗脱液合并。利用L-B反应以及起泡性将40%、50%乙醇洗脱液合并浓缩得油菜蜂花粉总皂苷。

2．3 油菜蜂花粉皂苷的纯化

将油菜蜂花粉总皂苷加水稀释，上样MCI柱(50 mm ×1500 mm)，调节流速15 mL/min，上样结束后加入1500 mL去离子水洗脱，再用30%、40%、50%、60%的乙醇梯度洗脱，15 mL试管收集，经TLC鉴定和硫酸茴香醛显色，将洗脱液分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个部分。将各部分浓缩至一定体积后再分别反复上ODS柱(30mm ×1000 mm)，分别用体积分数35% ～60%的乙醇-水梯度洗脱，洗脱流速5 mL/min，15 mL收集一管，经TLC鉴定纯度，共得4个纯化合物 1、2、3、4。

3 结构鉴定

以吡啶为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标物，将上述四个化合物经氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)等光谱数据分析，结合文献确定其化学结构。

化合物1 白色无定形粉末，可溶解于甲醇、乙醇、水，Liebermarm-Burchard反应呈阳性。从1H NMR 图谱可见，δ5．4有1个 H 信号，δ5．02有1个双峰质子信号，可能为糖的端基信号，推测该化合物含有 1 个糖基。δ1.25、1.20、1.16、1.14、0.95 有 5个单峰甲基，δ1.77，1.34，0.98 有 3 个双峰甲基，其余H信号难以分辨。13C NMR(C5D5N，125 MHz)δ:38.6(C-1)，28.9(C-2)，90.0(C-3)，42.5(C-4)，55.9(C-5)，18.6(C-6)，33.5(C-7)，42.5(C-8)，47.9(C-9)，36.6(C-10)，22.9(C-11)，122.6(C-12)，145.1(C-13)，42.6(C-14)，28.2(C-15)，26.6(C-16)，33.6(C-17)，61.0(C-18)，40.1(C-19)，31.1(C-20)，42.6(C-21)，72.6(C-22)，28.9(C-23)，17.1(C-24)，15.8(C-25)，18.6(C-26)，25.9(C-27)，25.9(C-28)，33.4(C-29)，24.2(C-30)，101.8(Glc-1)，74.7(Glc-2)，76.9(Glc-3)，71.0(Glc-4)，75.8(Glc-5)，63.7(Glc-6)。

从13C NMR可见到36个碳信号，除6个糖信号外，苷元上有30个碳，分析化合物为皂苷，δ145.1、122.6处有2个双键碳信号，从此信号可判断该化合物母环为齐墩果烷型皂苷元。与标准齐墩果烷型皂苷的核磁共振碳谱和135DEPT图谱比较发现，C-3的化学位移值从72移动到90.0，说明C-3成苷，δ72.6处有1个连氧CH信号，说明除C-3外还有被羟基取代的碳，分析所有碳信号并与标准齐墩果烷型皂苷的碳谱比较可判断C-22有羟基取代，其化学位移置向低场移动31，C-21也向低场移动10，由此可得该化合物的苷元部分为3，22二羟基—齐墩果烷皂苷。糖的链接方式:从化学位移置来看为葡萄糖，与苷元的C-3相连。综合以上分析并参照相关文献可知该化合物为3，22二羟基，3-O-β-D-葡萄糖-齐墩果烷。结构式如图1。

化合物2 白色无定形粉末，可溶解于甲醇、乙醇、水，Liebermarm-Burchard反应呈阳性。从1H NMR图谱可见，δ5.6有1个双峰H信号，可能双键H信号，δ5.13有1个质子信号，应为糖的端基信号，该化合物连有 1 个糖基。δ1.31、1.28、1.20、1.19、0.93 有 5 个单峰甲基，δ1.78，1.32，0.96 有 3个双峰甲基，其余 H信号难以归属。13C NMR(C5D5N，125MHz)δ:38.8(C-1)，29.6(C-2)，91.1(C-3)，42.5(C-4)，56.2(C-5)，18.7(C-6)，33.5(C-7)，42.5(C-8)，47.9(C-9)，36.5(C-10)，23.2(C-11)，122.6(C-12)，145.0(C-13)，42.6(C-14)，28.8(C-15)，26.6(C-16)，33.5(C-17)，61.9(C-18)，40.1(C-19)，31.1(C-20)，42.5(C-21)，72.6(C-22)，30.1(C-23)，19.1(C-24)，17.1(C-25)，18.7(C-26)，23.2(C-27)，26.0(C-28)，33.4(C-29)，24.2(C-30)，101.9(Glc-1)，78.6(Glc-2)，75.8(Glc-3)，71.4(Glc-4)，76.5(Glc-5)，69.5(Glc-6);102.3(Glc-1')，74.1(Glc-2')，76.8(Glc-3')，72.6(Glc-4')，76.3(Glc-5')，61.0(Glc-6');105.4(Glc-1″)，74.6(Glc-2″)，77.4(Glc-3″)，72.1(Glc-4″)，76.7(Glc-5″)，63.7(Glc-6″)。

从13C NMR可见到48个碳信号，除18个糖信号外，苷元上有30个碳，与化合物1相比较，苷元部分的化学位移值基本一致，说明化合物2与化合物1具有相同的苷元结构，二者不同仅在于糖链部分。化合物2有三个糖，从化学位移值来看三个糖都为葡萄糖。糖的链接方式:端基信号101.9的糖与苷元相连，另二个糖分别连在该糖的2、6位上。综合以上分析可知该化合物为3，22二羟基，3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-［-β-D-吡喃葡萄糖 (1→6)］—齐墩果烷。结构式如图1。

化合物3 白色无定形粉末，可溶解于甲醇、乙醇、水，Liebermarm-Burchard反应呈阳性。从1H NMR图谱可见，δ5.4有1个双峰H信号，δ5.08有1个质子信号，为糖的端基信号，推测该化合物含有1 个糖基。δ1.29、1.23、1.20、1.17、0.96 有 5 个单峰甲基，δ1.81、1.33、0.99有3个双峰甲基，其余 H信号不能归属。

13C NMR(C5D5N，125 MHz)δ:38.8(C-1)，29.6(C-2)，91.1(C-3)，42.5(C-4)，56.2(C-5)，18.7(C-6)，33.5(C-7)，42.5(C-8)，47.9(C-9)，36.5(C-10)，23.2(C-11)，122.6(C-12)，145.0(C-13)，42.6(C-14)，28.8(C-15)，26.6(C-16)，47.7(C-17)，41.9(C-18)，40.1(C-19)，31.1(C-20)，42.5(C-21)，72.6(C-22)，30.1(C-23)，19.1(C-24)，17.1(C-25)，18.7(C-26)，23.2(C-27)，26.0(C-28)，33.4(C-29)，24.2(C-30)，101.9(Glc-1)，78.6(Glc-2)，75.8(Glc-3)，71.4(Glc-4)，76.5(Glc-5)，69.5(Glc-6);102.3(Glc-1')，74.1(Glc-2')，76.8(Glc-3')，72.6(Glc-4')，76.3(Glc-5')，61.0(Glc-6');105.4(Glc-1″)，74.6(Glc-2″)，77.4(Glc-3″)，72.1(Glc-4″)，76.7(Glc-5″)，63.7(Glc-6″)。

从13C NMR可见到48个碳信号，其中18个糖信号外，苷元上有30个碳，与化合物2相比较，糖链部分的化学位移置基本一致，说明化合物3与化合物Ⅱ具有相同的糖链结构，二者不同仅在于苷元部分。化合物3在δ175.3处有一个羧基，表明该化合物为齐墩果酸，对应有 C-17值为 47.7，C-18为41.9。综合以上分析可知该化合物为3，22二羟基，3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-［-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)］—齐墩果酸。结构式如图1。

化合物4 白色无定形粉末，可溶解于甲醇、乙醇、水。从1H NMR图谱可见，δ5.4有1个双峰H信号，δ5.02有1个质子信号，可能为糖的端基信号，推测该化合物含有1个糖基。δ1.03、0.94有2个单峰甲基，δ1.22、1.14、0.76有 3个双峰甲基，0.97处有一个多峰甲基。

13C NMR(C5D5N，125 MHz)δ:37.6(C-1)，32.3(C-2)，78.7(C-3)，39.9(C-4)，141.1(C-5)，122.0(C-6)，34.4(C-7)，32.2(C-8)，50.5(C-9)，36.5(C-10)，21.4(C-11)，39.4(C-12)，42.6(C-13)，56.4(C-14)，24.6(C-15)，28.7(C-16)，57.0(C-17)，12.1(C-18)，19.2(C-19)，36.3(C-20)，19.2(C-21)，32.3(C-22)，29.4(C-23)，46.2(C-24)，12.3(C-25)，32.2(C-26)，12.1(C-27)，26.6(C-28)，21.6(C-29)，102.7(Glc-1)，75.4(Glc-2)，78.6(Glc-3)，71.9(Glc-4)，78.3(Glc-5)，63.0(Glc-6)。

从13C NMR可见到35个碳信号，其中6个糖信号外，苷元上有29个碳，根据化学位移值判断该化合物为甾苷类化合物，对应C-3位连有一个葡萄糖。综合分析并参照文献可知该化合物为3-O-β-D-葡萄糖—谷甾醇苷。

图1 化合物1、2、3的化学结构Fig．1 Chemical structures of compounds 1，2 and 3

1 Cao W(曹炜)，Wei YH(尉亚辉)．The Principle and The Process Technology of Bee Health Care(蜂产品保健原理及开发)．Beijing:Chemical Industry Press，2002:128-136．

2 Hsiao WLW，TaiWCS，Mo Z，et al．Anticancer activities and the drug targets of botanical saponins from amedicinal herb，gynostemma pentaphyllum．J Acupunct Tuina Sci，2008，6:271-272．

3 Qin RL，Meng QS．Effects of total saponins fromRanunculus japonicason hypoxia tolerance and memory ability of mice．Med Plant，2011，2(6):41-42．

4 Wang JS，Zhang F，Tang L，et al．Neuroprotective effects of total saponins from Rubus parvifolius L．on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats．Neural Regen Res，2012，7:176-181．

5 Cheng D，Zhou B．Purification of total saponins in Fructus tribulibymacroporous adsorption resins．Med Plant，2011，2(8):44-45，48．