毛冬青中三萜皂苷类化合物的提取分离及电喷雾多级质谱快速分析研究

周中流，尹文清，何淑君，何晓容，冯宗财，夏敬民

1湛江师范学院化学科学与技术学院制药工程系;2湛江师范学院广东高校新材料工程技术开发中心，湛江524048

毛冬青为冬青科冬青属植物毛冬青的干燥根，是我国南方常用的中药材，具有清热解毒，活血通脉，消肿止痛的作用，临床上广泛应用于治疗冠心病、心绞痛、血栓闭塞性脉管炎、中心性视网膜炎和脉管炎等，有很好的疗效［1］。文献报道毛冬青根中的三萜皂苷类化合物具有降压、降脂消肥、正性肌力作用、促进血肿吸收和抗炎等功效，为其主要的活性成分［2］。近年来，毛冬青的研究主要集中在三萜皂苷的分离、纯化和结构鉴定方面［3-10］(见表1)，对该药材中三萜皂苷的全面分析和鉴定研究未见报道。余成霞［11］等采用HPLC-UV方法对毛冬青药材中的三萜皂苷成分分析，虽然建立了药材的指纹图谱，但仅鉴定了4种三萜皂苷的结构，仅占目前文献报道的皂苷数量的少部分。因此，建立一种能够对毛冬青中皂苷进行快速、全面分析的新方法，为中药毛冬青药材的质量控制及以毛冬青为原料的新药研发提供参考。

1 仪器与材料

Finnigan LCQDECA电喷雾离子阱质谱仪(美国Thermo-Finnigan公司)。毛冬青由桂林三金药业股份有限公司提供，药材经由广西师范大学生命科学院唐绍清教授鉴定为为冬青科植物毛冬青Ilex pubescens的干燥根(产地广西)。甲醇、氯仿和正丁醇等均为分析纯，柱层析硅胶(青岛海洋化工厂，300～400目)。薄层色谱显色用10%浓硫酸—乙醇加热显色;其它化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 样品处理

取毛冬青干燥根粉末50 g，在70℃下，以500 mL 70%甲醇溶液提取5次，每次1．5 h，合并提取液，减压浓缩得提取物3．7 g，提取物悬浮于30 mL水中，先用乙酸乙酯(30 mL×4)萃取，再用正丁醇(30 mL×6)萃取，合并正丁醇萃取液，减压浓缩得粗皂苷2．0 g。取粗皂苷2．0 g进行硅胶柱层析，以甲醇-氯仿-水(1∶9∶0．1→2∶8∶0．2→3．5∶6．5∶1→1∶1∶0．3，V/V)溶剂系统进行梯度洗脱，每个梯度洗脱250 mL，每50 mL收集一瓶，共收集20瓶。通过TLC 比较，得到 I、II、III三个组分。

2．2 质谱条件

电喷雾正、负离子扫描模式，扫描范围:m/z 50～2000;离子源喷射电压5 kV;毛细管温度250℃;毛细管电压±5 V;壳气(N2)流速20 L/min;离子阱压力3．2 × 107Pa;注射泵进样速度1．5μL/min;多级串联质谱(ESI-MSn)碰撞能量为40%。

2．3 组分Ⅰ的(±)ESI-MS分析

图1(a)和图1(b)分别为组分Ⅰ在正、负离子模式下的电喷雾质谱图。在正离子ESI-MS谱中出现各皂苷成分的［M+Na］+准分子离子峰，负离子ESI-MS谱中则为［M-H］-准分子离子峰。通过正、负离子质谱的综合推断，确定组分Ⅰ中皂苷的分子量分别为 586、652、664、704。

为了对检测到的各皂苷成分进行确认，对各准分子碎片离子进行二级或三级质谱分析。文献资料表明，毛冬青中三萜皂苷按其糖链结构主要分为C-3单糖链皂苷和C-3，28双糖链皂苷。单糖链皂苷的二级质谱中主要给出C-3位糖链依次脱去单糖基的碎片离子，而双糖链皂苷则优先在C-28位发生各单糖基的顺序断裂，脱去整个C-28位糖链后形成的离子峰为基峰，以之为母离子继续进行多级质谱实验则出现C-3位糖链的断裂［12］。表2给出了本研究检测到的各皂苷成分在负离子模式下的多级质谱中主要碎片离子的质量数。根据二级质谱数据并结合文献报道［3-10］，确定组分Ⅰ中含有 ilexoside E(8)、ilexolide A(16)、pedunculoside(13)和 ilexsaponin C(24)，其中，皂苷8、13、16 为单糖皂苷，18 为双糖皂苷(见表1)。

2．4 组分Ⅱ的(±)ESI-MS分析

图2(a)和图2(b)分别为组分Ⅱ在正、负离子模式下的电喷雾质谱图。综合分析可以确定组分Ⅱ中三萜皂苷的分子量分别为 766、782、898、910、912和928。其中，从毛冬青中分离得到分子量为766的皂苷有3个，分别为 ilexoside A(1)、ilexoside D(2)和Ziyu-glycoside I(12)，均含有两个糖基。从结构上分析，这三个皂苷的质谱裂解途径和所得产物的质荷比(m/z)均相同，在电喷雾质谱中很难一一区分。组分Ⅱ中其它三萜皂苷根据负离子模式下各准分子离子峰的二级质谱数据并结合文献报道，确定组分Ⅱ中还含有 ilexsaponins C(18)、ilexoside J(3)、ilexoside K(4)、ilexoside H(14)和 ilexsaponin B4(11)。在我们的前期研究中［13］，证明了毛冬青中含有 ilexoside A(1)、ilexoside D(2)、ilexoside J(3)和ilexoside K(4)。

2．5 组分III的(±)ESI-MS分析

图3(a)和图3(b)分别为组分Ⅲ的正、负离子质谱图。两者相互印证，确定组分Ⅲ中含有分子量依次为912、928、1056、1074 和1236 的皂苷类化合物。其中，分子量为912和928的化合物为组分Ⅱ中的两个成分，已完成对其结构的确认。分子量为1074和1056的两个化合物与文献报道的ilexoside O(5)和pubescenosides D(15)的分子量相吻合，多级质谱实验进一步确认它们的归属。在组分Ⅲ的全扫描质谱中发现了1个未见文献报道的化合物，分子量为1236。为了对它的结构进行推测，本研究对其在负离子模式下的准分子离子进行多级质谱检测。

图4是m/z 1235的准分子离子的二级质谱，谱中给出了基峰为m/z 911的碎片离子，同时还给出了m/z 1073、765、603和471等逐个脱去糖基的碎片离子。在负离子模式下二级质谱中，当毛冬青中双糖链皂苷的C-28位糖链较短时，C-28位糖链上的糖基优先顺序被裂解，整个C-28位糖链被脱去后的离子峰为基峰，检测不到整个C-28位糖链的碎片离子。通过分析图3(a)和图3(b)，确定m/z 911碎片离子代表苷元和3位糖链，同时C-28糖链应该是由两个六碳糖连接而成。文献报道毛冬青中双糖链皂苷的28位糖链通常由葡萄糖构成，提示该皂苷的C-28位糖链也可能是由一个“葡萄糖-葡萄糖”结构单元组成。为了进一步确定3位糖链和该皂苷苷元的结构，对m/z 911碎片离子进行了三级质谱实验。离子m/z 911的三级质谱(图5)给出了m/z 765、603和471的碎片离子，提示3位糖链末端为一个六碳糖，与苷元C-3位直接相连的为一个五碳糖，糖链中间是一个六碳糖;根据毛冬青三萜皂苷3位糖链的结构特征，该皂苷3位糖链很可能是由一个“木糖-葡萄糖-鼠李糖”结构单元组成;m/z471的出现提示苷元可能为pubescenolic acid。该未知三萜皂苷的具体结构需要通过分离和波谱鉴定进一步确定。

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表2 毛冬青中皂苷的多级质谱数据Table 2 Multiple-stagemass spectra of saponins from Ilex pubescens

注:*对此碎片离子进行MS3检测。Note:*The characteristic ion was determined by MS3．

3 讨论

电喷雾多级质谱因为其具有灵敏度高、分析速度快和消耗样品少等优点，适于分析皂苷结构。电喷雾质谱不仅可以直接用于确定混合皂苷中各单体皂苷的分子量，还可以通过多级质谱确定已知甚至未知的单体皂苷的化学结构。本研究利用全扫描电喷雾质谱结合硅胶柱层析方法对毛冬青根中的皂苷进行快速分析。通过多级质谱得到一系列皂苷的苷元和糖链的结构信息，结合文献报道，确认了其中11个已知的皂苷成分。同时，利用多级质谱技术对检测到的1个未见文献报道的皂苷的化学结构进行了合理的推测。本方法与HPLC-ESI-MS-MS技术相比，具有操作简单、成本低、效率高等优点。

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