苏芡种壳棕色素的提取及红外光谱分析

张晓云，卢 昊，王海刚，翟鑫宇，郑漓波，张雪婧

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013)

苏芡又名“南芡”、“南荡鸡头”等，为睡莲科芡属无刺芡栽培种，原产于我国江苏省苏州市。与北芡(刺芡)相比，其种仁粒大、圆整，煮食糯性、营养丰富、产量高，具有较高的经济价值，是目前国内唯一的优质芡实栽培品种。据不完全统计，我国“苏芡”栽种面积已超过10万亩［1］。目前，对苏芡产品的研究开发主要是一些粗加工的芡实米、芡实酱菜和以芡实茎根作原料的食用蔬菜［2］，对其坚硬种壳(约占其种子质量的30%～40%)的开发利用尚很欠缺，通常情况下被废弃或作普通燃料，不仅浪费资源，而且污染环境。研究表明，芡实种壳中含有较多的棕色素，其主要成分通常为多元酚类物质［3］;而多酚类物质由于特有的分子结构和化学特性使其具有抗肿瘤、抗氧化以及抗菌等多种生理功能［4－5］，已广泛被应用于医学、食品、日用化工等相关领域［6］。本文以苏芡种壳为原料，选择合适的溶剂提取其棕色素，经分离纯化后分别用红外光谱仪对其结构进行测定分析，为今后进一步综合开发利用苏芡资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苏芡种壳 购自苏州，经40℃烘干后用超微粉碎机粉碎过80目筛后备用;盐酸、NaOH、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等 均为分析纯。

TGL－16M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;SHZ－10组合式水浴摇床 太仓市实验设备厂;GZX－9240 MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Cary 100紫外可见分光光度计 美国瓦里安公司;ATAVAR型傅立叶变换红外(FT－IR) 美国Nicolet公司。

1.2 实验方法

1.2.1 棕色素提取剂的选择 分别称取1.0g粉碎苏芡种壳，按照料液比1∶25加入蒸馏水、1%HCl、2%NaOH、50%乙醇、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等不同提取剂，室温下振荡提取2h后经10000r/min离心10min，收集上清液定容至250mL备用。

将上述不同棕色素提取液分别通过全波长扫描确定其最大吸收波长，然后测定各提取液(稀释5倍)在其最大吸收波长处的吸光度，进行比较。

1.2.2 棕色素提取条件的优化

1.2.2.1 料液比对提取效果的影响 准确称取1.0g粉碎苏芡种壳，分别按照料液比(苏芡种壳:2%NaOH)1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 于锥形瓶中60℃下振荡提取2h后，经10000r/min离心10min。收集上清液定容至250mL，再稀释10倍于419nm处测定其吸光度。

1.2.2.2 时间对提取效果的影响 准确称取1.0g粉碎苏芡种壳，按照料液比(苏芡种壳∶2%NaOH)1∶25加入锥形瓶中。在60℃条件下分别振荡提取1、2、3、4、5、6h，经 10000r/min 离心 10min。收集上清液定容至250mL，再稀释10倍于419nm处测定其吸光度。

1.2.2.3 温度对提取效果的影响 准确称取1.0g粉碎苏芡种壳，按照料液比(苏芡种壳∶2%NaOH)1∶25加入锥形瓶中。在 30、40、50、60、70、80℃条件下分别振荡提取2h，经10000r/min离心10min。收集上清液定容至250mL，再稀释10倍于419nm处测定其吸光度。

1.2.2.4 最佳提取工艺条件的确定 选取温度、时间、料液比为考察因素，每个因素取3个水平(见表1)，用L9(34)正交表安排实验，对棕色素提取条件进行优化设计，筛选最佳工艺。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.3 棕色素的纯化与红外光谱分析

1.2.3.1 棕色素粗制品的制备与纯化 称取100g粉碎苏芡种壳，按照料液比 1∶30(苏芡种皮∶2%NaOH)，60℃下振荡提取3h后经10000r/min离心分离10min。将上清液经减压浓缩后分两等份分别经方法Ⅰ(酸沉法)和方法Ⅱ(醇沉法)进行纯化处理［7］。

方法Ⅰ:取上述棕色素粗提取液于离心管中，边摇边滴加3mol/L HCl至出现浑浊时，放置冰箱中1h，经10000r/min离心分离10min。向得到的沉淀物滴加0.1mol/L NaOH至沉淀刚溶解，如此重结晶三次。将沉淀物于50℃干燥，得纯化棕色素Ⅰ。

方法Ⅱ:取上述棕色素粗提取液于离心管中，边摇边滴加无水乙醇，直至棕色素溶液沉淀完全时置于冰箱中充分沉淀1h，经10000r/min离心分离10min。将沉淀物于50℃干燥，得纯化棕色素Ⅱ。

1.2.3.2 棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的红外光谱分析 分别取适量经105℃干燥6h后的棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ，加入无水溴化钾粉末，用研钵充分磨细、混匀、装模，置于压片机上抽真空2min，加压至100000N/cm2，受压10min，把样品压成0.1～1.0mm厚的芯片。将芯片置于红外光谱仪的样品光路中，波数范围为400～4000cm－1，记录其IR数据。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂对棕色素提取效果比较

为准确比较甲醇、乙酸乙酯、乙醇、盐酸等不同提取剂对苏芡种壳中棕色素的提取效果，分别测定各不同溶剂提取液在其最大吸收波长处的吸光度，结果见表2所示。

表2 不同溶剂提取棕色素的吸光度比较Table 2 Adsorption of different solvents on extraction of brown pigment

由表2可以看出，用2%NaOH溶液对苏芡种壳中棕色素的提取效果最好，其次是水和50%乙醇，甲醇、乙酸乙酯、无水乙醇、1%盐酸对苏芡种壳棕色素的提取能力较差。综合考虑，选择2%NaOH溶液为提取剂。

2.2 各因素对棕色素提取效果的影响

2.2.1 料液比对提取效果的影响 如图1所示，增加料液比可显著提高对苏芡种壳棕色素的提取效果，但料液比增加到1∶25以后，继续增加料液比不能带来提取效果的显著性增加。所以从提取效果和节约成本两方面考虑，确定料液比在1∶20～1∶30比较适宜。

图1 料液比对棕色素提取效果的影响Fig.1 Influence of material－liquid ratio on the extraction effect of brown pigment

2.2.2 提取时间对提取效果的影响 由图2可以看出，提取时间在2h内，提取液吸光度随着时间延长增加;当提取时间超过2h，吸光度随着提取时间的增加反而出现下降趋势。这可能是由于棕色素在该提取条件下不稳定，随着提取时间增加出现了少量分解所致［8］。因此，选择提取时间为2h左右较为适宜。

图2 提取时间对棕色素提取效果的影响Fig.2 Influence of extracting time on the extraction effect of brown pigment

2.2.3 提取温度对提取效果的影响 如图3所示，随着提取温度的升高，提取液吸光度值增加，但超过40℃后吸光度值增加幅度减小。根据文献［9－10］研究报道，棕色素在温度80℃以上时不稳定，可能会导致色素分子结构发生不可逆的变化。因此，提取温度选择在40～60℃。

图3 提取温度对棕色素提取效果的影响Fig.3 Influence of extracting temperature on the extraction effect of brown pigment

2.2.4 色素最佳提取条件的确定 按照表1因素水平条件进行正交实验，结果如表3所示。由表3可以看出，各因素对苏芡种壳中棕色素提取效果的影响顺序为:提取温度＞提取时间＞料液比。实验条件A3B3C2即提取温度为60℃、提取时间为3h、料液比为1∶25对苏芡种壳中棕色素的提取效果较好。为进一步确认棕色素的最佳提取条件，根据单因素实验和正交实验的分析结果，选取实验条件 A3B3C2和A3B3C3进行验证，实验结果表明A3B3C2条件下苏芡种壳棕色素提取液的吸光度值为0.860，A3B3C3条件下的吸光度值为0.871。综合考虑，确定苏芡种壳中棕色素的最适提取条件为 A3B3C3，即提取温度为60℃、提取时间为 3h、料液比为 1∶30。

表3 正交实验结果分析Table 3 Result analysis of orthogonal experimental design

2.3 苏芡种壳棕色素的红外光谱分析

图4是经酸沉法和醇沉法得到的棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的红外光谱图。由图4可见，两种棕色素的波形和波数存在一定差异。二者在3390.30cm－1处均有一个较强的吸收峰，这是酚类物质的重要特征，是由O－H伸缩振动引起的吸收峰;在 1633.44、1456.02、1338.38cm－1均出现略强的吸收峰，其中1633.44cm－1处为芳香环的伸缩振动峰;在3043.17、2989.17、1112.74、1051.31cm－1处均出现较小的吸收峰。二者差异主要在于:棕色素Ⅰ在 2925.53、2854.18、1716.36、1234.24cm－1处出现强弱不等的吸收峰，主要是亚甲基和酯羰基的伸缩振动峰，C－N和N－H的伸缩振动峰;棕色素Ⅱ在867.82、815.75、777.18cm－1处出现强弱不等吸收峰，主要是芳香环的一取代面外弯曲振动峰。

图4 棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的红外光谱图Fig.4 IR spectrogram of pigmentⅠand pigmentⅡ

红外光谱分析可知，苏芡种壳棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的结构中均存在芳香环，棕色素Ⅰ中存在着酯羰基结构，且具有C－N，而棕色素Ⅱ中不存在这些结构，但其芳香环上具有棕色素Ⅰ没有的取代基。对于苏芡种壳棕色素的具体主要组成，尚需进一步采用合适的方法如高效毛细管电泳、高效液相色谱法、高速逆流色谱、质谱和核磁共振谱等［11］对其主要成分进行进一步分离和结构确认。

3 结论

3.1 与50%乙醇、甲醇、乙酸乙酯、无水乙醇、1%盐酸等提取剂相比，2%NaOH溶液对苏芡种壳中棕色素的提取效果较好。在单因素实验的基础上，通过实验综合确定用2%NaOH溶液提取苏芡种壳中棕色素的最佳条件为:料液比1∶30，提取温度60℃，提取时间3h。

3.2 对提取的棕色素利用酸沉法和醇沉法分别进行纯化处理得到的棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ。红外分析表明棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ结构中均存在芳香环。但棕色素Ⅰ中存在着酯羰基和C－N结构;而棕色素Ⅱ中不存在这些结构，其芳香环上具有棕色素Ⅰ没有的取代基。对于苏芡种壳棕色素的具体主要组成尚需进一步采用合适的方法进行分离和确认。

［1］鲍忠洲.优质芡实—苏芡［M］.南京:江苏科学技术出版社，2010.

［2］王和才.芡实种皮总鞣质的提取及含量测定［J］.食品工业科技，2009，30(8):224－226.

［3］纪俊玲，李小琴，王炜，等.芡实壳天然染料的提取及染色性能［J］.印染，2011(3):4－7.

［4］Ruberto G，Renda A，Daquino C，et al.Polyphenol constituents and antioxidant activity of grape pomace extracts from five Sicilian red grape cultivars［J］.Food Chemistry，2007，100(1):203－207.

［5］Hudson T S，Hartle D K，Hursting S D，et al.Inhibition of prostate cancer growth by muscadine grape skin extract and resveratrol through distinct mechanisms［J］.Cancer Research，2007，67(17):8396－8405.

［6］左丽丽，王振宇，樊梓鸾，等.植物多酚类物质及其功能研究进展［J］.中国林副特产，2012(5):39－41.

［7］韩海霞，包晓玮，傅力，等.核桃外果皮棕色素的提取纯化及其稳定性研究［J］.中国农学通报，2009，25(22):83－87.

［8］李卫，邵友元，胡立新.栀子黄色素的提取工艺及热分析［J］.冷饮与速冻食品工业，2002(2):29－31.

［9］吕凯，詹少华，林毅.棉籽壳棕色素的提取纯化及其稳定性研究初报［J］.中国农学通报，2006，22(9):81－84.

［10］李永祥，詹少华，蔡永萍，等.板栗壳色素的提取、纯化及稳定性［J］.农业工程学报，2008，24(9):298－302.

［11］吴丽媛，罗向东，戴亮芳，等.杜鹃花色素的分离与鉴定分析［J］.食品科学，2011，32(13):20－22.