视网膜母细胞瘤和正常视网膜组织中VEGF-C表达和淋巴管计数的研究

沈宏伟，李芸，唐罗生，杨竹林，郭小健

(中南大学湘雅二医院， 长沙 410011)

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是婴幼儿时期最常见的眼内恶性肿瘤，我国目前由于医疗条件的限制，仍可见晚期病例耳前及颈部淋巴结转移，预后较差。研究发现血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C) 可促进肿瘤组织内淋巴管的生成，且其表达水平与恶性肿瘤进展、转移、侵袭能力及预后密切相关[1～5]。D2-40为新近发现的特异性及敏感性均高的淋巴管识别的单克隆抗体，可用作淋巴管计数[6～8]。国内外未见RB组织中VEGF-C表达及淋巴管计数及其与病例的临床、病理特征关联的报道[9]。本研究拟探讨RB组织中VEGF-C表达水平和淋巴管计数的变化相互关系及其临床病理意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

30例RB 组织来自1996年1月～2005年10月中南大学湘雅二医院眼科临床诊断为RB行眼球摘除手术并经病理证实的标本，男性18例(60.0%)，女性12例(40.0%)；年龄范围4月至6岁，其中<1岁8例(26.7%)、1～3岁14例(46.7%)，>3岁8例(26.7%)，无双眼发病病例。就诊时症状和体征：白瞳23例(76.7%)，视力下降9例(30.0%)，患眼疼痛7例(23.3%)，眼球突出8例(26.7%)，眼压升高4例(13.3%)，斜视3例(10.0%)。临床分期：眼内期(Ⅰ期)13例(43.3%)，青光眼期(Ⅱ期)10例(33.3%)，眼外期(Ⅲ期)7例(23.3%)。病理分型：分化型11例(36.7%)，未分化型19例(63.3%)，但有时两型界限难以严格区分。侵袭和转移：肿瘤侵犯视神经13例(43.3%)，未侵犯视神经17例(56.7%)。眼球摘除合并术后放疗4例(13.3%)。生存时间：随访术后2年内复发扩散死亡11例，2年后仍生存者19例。15例正常视网膜组织标本11例来自RB瘤旁病理检查证实为正常组织的视网膜，4例来自角膜移植术后的正常成人尸体眼。标本常规制作4 μm厚石蜡包埋切片。

1.2 主要试剂

鼠抗人D2-40单克隆抗体、兔抗人VEGF-C多克隆抗体：北京中杉生物技术公司；Envision TM标记试剂盒：上海基因生物技术公司。

1.3 方法

Envision TM免疫组化法进行VEGF-C和D2-40的染色。以抗体公司提供的阳性切片作为阳性对照，0.01 mol/L PBS液(pH 7.4)代替VEGF-C抗体作为阴性对照。细胞浆内含棕黄色颗粒者为VEGF-C阳性细胞，以切片中阳性细胞≥20%为阳性病例，<20%为阴性病例。D2-40标记阳性的淋巴管为棕黄色管腔样结构，参照Kaiserling[10]的方法，先在低倍镜下选择淋巴管最丰富区域，在高倍镜下计数5个视野淋巴管数，取其均值为该切片淋巴管数；以扁桃体石蜡切片组织作为阳性对照， 0.01 mol/L PBS液(pH 7.4)代替D2-40抗体作为阴性对照。分析VEGF-C、D2-40表达关系及与病例的临床病理特征之间的关系。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 RB和正常视网膜组织中VEGF-C表达及淋巴管计数情况

VEGF-C免疫组化反应产物定位于胞浆和(/或)胞核(图1)；D2-40标记阳性的淋巴管分布于肿瘤组织和肿瘤间质中(图2)。 30例RB中VEGF-C阳性表达16例 (53.3%)， 淋巴管计数为 (11.8±3.6) 个/HP， 15例正常视网膜组织中VEGF-C均阴性，淋巴管计数为 (4.3±2.4)个/HP； RB中VEGF-C表达阳性率及淋巴管计数均明显高于正常视网膜组织 (VEGF-C：χ2=12.41，P<0.01；淋巴管计数：t=7.28，P<0.01)。

2.2 VEGF-C表达及淋巴管计数与RB主要临床病理特征的关系

临床分期Ⅰ期、病理分型为分化型、未侵犯视神经及生存期≥2年病例VEGF-C的表达阳性率及淋巴管计数明显低于临床分期Ⅲ期、未分化型、侵犯视神经及生存期<2年的病例(P<0.05或P<0.01)，见表1。性别、年龄、发生部位、就诊时临床表现及治疗方法等临床特征与VEGF-C表达和淋巴管计数无明显关系(P>0.05)。

2.3 RB组织中VEGF-C表达与淋巴管计数的关系

16例VEGF-C阳性病例中淋巴管计数为(148±4.2)个/HP，14例VEGF-C阴性病例中淋巴管计数为(8.4±4.6)个/HP，两者存在显著性差异(t=2.58，P<0.01)。

表1 RB主要临床病理特征与VEGF-C表达和淋巴管计数的关系

注：分别与Ⅰ期、分化型、未侵犯视神经及生存期<2年比较，

*P<0.05, **P<0.01

图1 VEGF-C阳性表达，未分化型RB>Envision免疫组化法， ×200

图2 淋巴管计数为28个/HP，未分化型RB Envision免疫组化法， ×200

3 讨 论

肿瘤诱导的淋巴管生成是肿瘤淋巴道转移的重要机制。多种恶性肿瘤细胞能产生VEGF-C，VEGF-C能促进淋巴管内皮细胞的有丝分裂和增殖，是强烈的促肿瘤淋巴管生成因子，能通过自分泌和旁分泌的方式促进肿瘤淋巴管的生成[1～5]。研究显示，VEGF-C与恶性肿瘤细胞的淋巴道扩散有密切关系，故在胃癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤作为淋巴侵犯的临床病理评价及预后指标之一[1～5]。VEGF-C在多种恶性肿瘤中被证实其表达水平与转移发生、侵袭能力和生存率有密切关系，高水平表达者易发生转移，侵袭周围组织能力强，生存期较短。

肿瘤胚胎性抗原M2A是一种40kD的唾液酸糖蛋白，在淋巴管内皮细胞特异性表达而不在血管内皮细胞表达。D2-40可识别M2A的一个固定抗原表位，因而被作为一种特异性的淋巴管标记物[6]，用来标记淋巴管内皮，用以淋巴管计数[6]。 新生的淋巴管由单层细胞组成，无基底层，细胞间紧密连接较少，有潜在腔隙，有利于肿瘤细胞进入淋巴管。肿瘤组织中高表达的VEGF-C造成新生的淋巴管密度增加，使瘤细胞有更多机会侵入毛细淋巴管进入区域淋巴结，形成淋巴道转移[5～8]。研究证实淋巴管计数与恶性肿瘤的进展、血道转移及预后有密切关系，淋巴管计数高者进展快，易发生血道转移，预后差[5～8]。

目前对RB内VEGF的研究主要集中在VEGF-A，对VEGF-C和淋巴管的情况研究很少，已有的研究在RB细胞系HXO-RB44发现VEGF-C也有一定的高表达[11]，与本研究实验结果基本一致。本组资料发现RB中VEGF-C表达阳性率和淋巴管计数均明显高于正常视网膜组织；临床分期Ⅰ期、分化型、未侵犯视神经及生存期≥2年RB病例VEGF-C表达阳性率明显低于临床分期Ⅲ期、未分化型、侵犯视神经和生存<2年病例；VEGF-C阳性表达RB中淋巴管计数明显高于阴性病例。以上结果提示RB组织中VEGF-C表达水平和淋巴管计数正相关，可能具有促瘤内淋巴管生成的作用，VEGF-C表达水平和淋巴管计数可能是反映RB发生、进展、生物学行为和预后的新标记物。

[参考文献]

[1] Shida A, Fujioka S, Kobayashi K, et al. Expression of Vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and D in gastric carcinoma[J]. Int J Clin Oncol, 2006, 11(1):38-24.

[2] Su JL, Yang PC, Shih JY, et al. The VEGF-C/Flt-4 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells[J]. Cancer Cells, 2006, 9(3):209-223.

[3] Bando H, Weich HA, Horiguchi S, et al. The association between vascular endothelial growth factor-C, its corresponding receptor, VEGFR-3, and prognosis in primary breast cancer: a study with 193 cases[J]. Oncol Rep, 2006, 15(3): 653-659.

[4] Kojima H, Shijubo N, Yamada G, et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor-C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with T1 lung adenocarcinoma[J]. Cancer, 2005, 104(8):1668-1677.

[5] Schneider M, Buchler P, Giese N, et al. Role of lymphangiogenesis and lymphangiogenic factors during pancreatic cancer progression and lymphatic spread[J]. Int J Oncol, 2006, 28(4):883-890.

[6] Kaiseling E. Immunohistochemical identification of lymph vessels with D2-40 in diagnostic pathology[J]. Pathologe, 2004, 25(5):362-374.

[7] Myona E, Nomikos A, Alexandrou P, et al. Lymphatic Lymphatic and blood vessel morphometry in invasive breast carcinomas: relation with proliferation and VEGF-C and -D proteins expression[J]. Histol Histopathol, 2007, 22(8):825-835.

[8] Adachi Y, Nakamura H, Kitamura Y, et al. Lymphatic vessel density in pulmonary adenocarcinoma immunohistochemically evaluated with anti-podoplanin or anti-D2-40 antibody is correlated with lymphatic invasion or lymph node metastases[J]. Pathol Int, 2007, 57(4):171-177.

[9] 王仪， 唐秀如， 林振石. 98例视网膜母细胞瘤的临床病理研究[J]. 福建医药杂志, 2000,22(4):8-9.

[10] Kaiserling E. Immunohistochemical identification of lymph vessels with D2-40 in diagnostic pathology[J]. Pathologe, 2004,25(5):362-374.

[11] 体外培养的人视网膜母细胞瘤细胞株及其肿瘤血管生成相关因子表达的实验研究[J]. 中华眼科杂志，2005,41(5)：419-422.