溪黄草中总黄酮的微波辅助提取工艺研究

黄冬兰，陈小康，徐永群，梁俊发

（韶关学院 化学与环境工程学院，广东 韶关512005）

溪黄草Rabdosia serra(Maxim)Hara属于唇形香茶菜属植物，为民间习用草药，多用于清热利湿、凉血散淤和治急性黄疸肝炎、急性胆囊炎等症，并被用作成药消炎利胆片、胆石通胶囊及复方胆通胶囊的原料之一.研究发现，溪黄草含有萜类、黄酮类、酚类、氨基酸等活性成分［1］.其中，黄酮类为一类生物活性较强的成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗溃疡、降血脂、抗心律失常、抑制表皮黑色素生成、防止皮肤癌等功效［2-3］.黄酮类化合物因其药效显著且副作用极小，已成为科研工作者研究的热点之一.

目前，黄酮类化合物的提取方法主要有：微波辅助提取法、有机溶剂提取法、超临界流体萃取法、酶辅助提取法、超声辅助提取法等［4］.其中，微波辅助提取法因其具有效率高、选择性强、萃取时间短、溶剂用量少、污染小等优点，已被广泛地应用于黄酮类化合物提取工艺研究中［5-8］.本文作者采用单因素法和正交试验法对溪黄草中总黄酮的微波提取工艺条件进行了研究，旨在建立快速提取溪黄草中总黄酮的生产工艺，为开发利用溪黄草药材提供参考.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：722S分光光度计 （上海棱光技术有限公司）；KJ23C-AN2微波炉 （广东美的微波炉制造有限公司）；AUY-220分析天平（岛津国际贸易（上海）有限公司）；878B粉碎机（江苏省金坛市通济仪器厂）.

试剂：芦丁标准品，中国药品生物制品检定所；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠，分析纯；实验用水为去离子水.

1.2 样品的前处理

1.2.1 样品的取样和洗涤：溪黄草样品采于韶关市翁源县，用清水漂洗干净后，再用蒸馏水洗3次，置于60℃烘箱中干燥12 h，烘干至恒重，粉碎后过20目筛，于干燥器中保存备用.

1.2.2 样品的提取与试液制备：准确称取上述备用样品1.000 0 g，置于微波消解罐中，加入适量一定浓度的乙醇溶液，放在微波炉中加热提取，冷却后过滤，收集滤液，然后用相应浓度的乙醇溶液定容至50 mL，冷藏备用.

1.3 分析方法

1.3.1 标准曲线的绘制

采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法.精密量取芦丁标准溶液(ρ=0.208 mg/mL)0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分别置于50 mL比色管中，加入1.00 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，静置6 min，加入1.00 mL 10%硝酸铝溶液，迅速振荡混匀，静置6 min，再加入10.00 mL 4%氢氧化钠试液，摇匀后加65%乙醇溶液定容，摇匀，放置15 min.以试剂空白作参比，用1 cm比色皿在510 nm波长处测定吸光度.以质量（mg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线.

1.3.2 总黄酮含量测定

取1.00 mL溪黄草试液于25 mL比色管中，以下操作同1.3.1，测定其在510 nm处吸光度，根据标准曲线，计算总黄酮含量.

2 结果与讨论

2.1 单因素考察

2.1.1 乙醇浓度的确定

固定料液比为1∶20，微波功率为中高火，微波萃取时间为4 min，考察了乙醇浓度分别为65%、70%、75%、80%时溪黄草总黄酮的提取率.测定结果如图1所示，结果表明：当乙醇浓度为70%时，溪黄草总黄酮的提取率最高.但乙醇浓度为65%时，总黄酮的提取率已达0.53%，与用70%乙醇溶液所得的提取率0.55%差别不大，为减少乙醇溶剂用量，倡导绿色化学理念，选取乙醇溶剂的浓度为65%.

图1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

2.1.2 料液比的确定

在固定溶剂乙醇的浓度为65%，微波功率为中高火，微波萃取时间为4 min的条件下，通过改变料液比（溪黄草质量∶65%乙醇的体积，g/mL）=1∶10、1∶15、1∶20 和 1∶25，测得料液比对总黄酮提取率的影响，结果如图2所示.实验结果表明：当料液比为1∶15时，溪黄草中总黄酮提取率最高.

2.1.3 微波时间的确定

在固定溶剂乙醇的浓度为65%，微波功率为中高火，料液比为1∶15（g/mL）的条件下，通过改变微波时间来探讨微波提取时间对总黄酮提取率的影响.本实验对微波时间分别为2、3、4、5、6、7 min进行了考察，实验结果表明：当微波时间为6 min，提取溪黄草总黄酮明显优于其他几组的提取效果，但当微波时间达到4 min后提取率上升不明显（见图3），基于成本考虑，选取微波时间为4 min.

图2 料液比对总黄酮提取率的影响

图3 微波时间对总黄酮提取率的影响

2.1.4 微波功率的确定

在固定料液比为1∶15（g/mL），微波萃取时间为4 min的条件下，通过改变微波功率来探讨微波功率对溪黄草总黄酮提取率的影响.本实验对微波功率为低火、中低火、中火、中高火和高火进行了考察，结果表明：微波功率为中火时总黄酮的提取率最高（见图4）.当微波功率高于中火时提取率反而降低.可能是由于微波功率太大，水分子吸收的微波能量过高，在植物细胞内形成的内热源过于强烈，导致细胞壁破裂后溶剂分子迅速蒸发，总黄酮等有效成分来不及从细胞中流出来进入溶剂中［9］.微波功率过小，则微波作用发挥不完全，总黄酮不能完全提取到溶剂中，使提取率降低.

图4 微波功率对总黄酮提取率的影响

2.2 正交试验确定最佳提取工艺

为了确定各因素间的相互作用对总黄酮提取效果的影响，在上述单因素试验的基础上，选定4因子3水平进行正交试验，因素水平见表1，正交试验结果见表2.

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验测定结果

由表1和表2可以看出，四因素对总黄酮提取率的影响依次为：微波时间〉料液比〉乙醇浓度〉微波功率.从各水平的总提取率来看，最优组合为A1B1C2D3，即微波功率为中火，微波时间为4 min，乙醇浓度为70%，料液比为1∶20，在此最佳条件下，溪黄草中总黄酮的提取率为1.15%.

3 结论

本研究采用单因素法和正交试验法对溪黄草中总黄酮的微波提取工艺条件进行了优化.确定其最佳提取条件为：微波功率为中火，微波时间为4 min，乙醇浓度为70%，料液比为1∶20.经试验验证，在此最佳条件下，溪黄草中总黄酮的提取率为1.15%.微波辅助提取法具有提取效率高、选择性强、节省时间、节省溶剂、方法简便等优点.由此可知微波辅助提取法在提取溪黄草中总黄酮方面有明显的优势，具有广阔的应用前景.

［1］吴剑峰.溪黄草的研究综述［J］.时珍国医国药,2003,14(8):498-500.

［2］贾国惠,贾世山.甘草中黄酮的药理作用研究进展［J］.中国药学杂志,1998,33(9):513-515.

［3］季宇彬,姜薇,范玉玲,等.甘草黄酮的研究进展［J］.中草药,2004,35(9):5-6.

［4］佟永薇.黄酮类化合物提取方法的研究及展望［J］.食品研究与开发.2008,29(7):188-190.

［5］吴洪特,刘霞.微波辅助法提取芥菜中的总黄酮工艺研究［J］.安徽农业科学,2008,36(27):11800-11801.

［6］林燕铃,周文富.微波提取苹果渣中总黄酮的工艺研究［J］.应用化工,2011,40(2):311-314,334.

［7］向昌国,向宁,黄成龙,等.响应面法优化刺槐花黄酮类化合物的微波提取工艺［J］.2011,32(22):32-36.

［8］陈金娥,匡强民,张海容.正交优化-微波辅助提取银杏叶黄酮［J］.2011,28(2):623-626.

［9］刘艳芳,安广杰.微波辅助提取夏枯草中熊果酸的工艺［J］.安徽农业科技,2007,35(34):941-942.