手工MGIT系统在基层结核病实验室中检测分枝杆菌的效果评价

孙灵利 赵平 张建花 郭娇 王甦民

结核病仍然是威胁人类健康的重要疾病，中国结核病患病率位居世界第二[1]，而耐药肺结核位居世界第一[2]。结核病的早期发现对结核病的控制至关重要，而细菌学诊断在结核病确诊及传染源的发现中起着决定性作用。细菌学诊断包括痰涂片找抗酸杆菌和培养。显微镜镜检是最普及和经济的方法，但敏感度低，并且不能区分死菌还是活菌。在我国培养法使用最多的是罗氏(Löwenstein-Jensen，L-J)固体培养法，但其培养周期长，后来出现的快速培养系统如BacT/ALERT 3D系统和美国BD公司的自动BACTEC MGIT 960系统(automated BACTEC MGIT 960 system, A-MGIT)在分枝杆菌培养时间和阳性率方面均高于传统的L-J固体培养方法，但这两种培养系统仪器和试剂价格均较昂贵。最近出现的手工MGIT系统(manual mycobacteria growth indicator tube system，M-MGIT)价格低廉，设备小巧轻便，适合基层实验室使用。本研究主要对M-MGIT系统与L-J法和A-MGIT系统的培养结果进行比较，评价其分离培养分枝杆菌的临床应用价值。

材料和方法

一、材料

1. 标本来源：2012年1月至2013年2月，北京市朝阳区疾病预防控制中心结核病门诊初诊患者，按照《肺结核诊断标准(WS 288-2008)》，根据患者临床症状、体征及胸部影像学检查确诊或高度疑似为肺结核的患者纳入本次研究。共有526例患者纳入研究，其中男328例，女198例；平均年龄(35±14)岁，最小年龄15岁，最大年龄97岁。每例患者送检3份痰标本，分别为夜间痰、晨痰和即时痰，选取1份合格的、痰量在3～10 ml的痰标本纳入本研究，共有526份痰标本纳入本次研究。

2. 仪器和试剂：A-MGIT培养系统包括：BACTEC MGIT 960 自动培养仪，7 ml液体培养管，MGIT营养添加OADC(oleic acid-albumin-dextrose-catalase)，MGIT杂菌抑制剂PANTA(polymyxin B, amphotericin B, nalidixic acid, trimethoprim, and azlocillin)杂菌抑制剂，均为美国BD公司生产。M-MGIT培养系统包括：荧光判读仪，4 ml液体培养管，MGIT OADC营养添加剂，MGIT PANTA杂菌抑制剂，均为美国BD公司生产。L-J培养基和抗酸染色液均由珠海贝索生物有限公司生产。

二、方法

1. 涂片染色镜检及标本的前处理：每份痰标本先进行涂片，涂片后剩余的标本进行处理后培养。涂片染色镜检及标本前处理均按照文献[3]规程操作，标本处理采用N-乙酰半胱氨酸-氢氧化钠(NALC-NaOH)法。

2. L-J培养基分离培养：每份经NALC-NaOH法处理的标本接种2支改良L-J培养基，每支L-J培养基接种0.1 ml，放置37 ℃恒温培养箱培养，接种后3、7 d分别观察结果1次，然后每周观察结果1次。发现菌落生长，经抗酸染色证实为抗酸分枝杆菌后报告阳性，若为阴性报告污染。若观察满8周仍无菌落生长，可报告阴性。

3. A-MGIT分离培养：将1瓶营养添加剂MGIT OADC和1瓶杂菌抑制剂MGIT PANTA混合，取0.8 ml混合液加到7 ml液体培养管中。每支培养管中接种NALC-NaOH处理后的同份标本(每份标本处理完后分别接种L-J培养基2支，A-MGIT培养管1支，M-MGIT培养管1支)0.5 ml，接种后培养管经扫描确认，放入全自动BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养仪中培养，由仪器自动监测。仪器提示阳性后取出，对培养物进行涂片，经抗酸染色镜检后证实为抗酸分枝杆菌后报告阳性，若为阴性报告污染，阴性结果为培养42 d后仪器报告阴性后取出，对培养管底部沉淀物进行抗酸染色镜检，判定是否假阴性。

4. M-MGIT分离培养：接种标本前，在4 ml液体培养管中分别加入0.5 ml 营养添加剂和0.1 ml 杂菌抑制剂，然后每管接种经NALC-NaOH 法处理的同份标本0.5 ml，放置37 ℃恒温培养箱培养。从培养的第2天开始，每天用荧光判读仪对培养管进行检测。荧光判读仪报告阳性者，对培养物进行涂片，抗酸染色镜检证实为抗酸分枝杆菌后报告阳性，若为阴性报告，则报告污染。培养管连续培养、监测6周时，若荧光判读仪报告阴性，则标本报告为阴性，并对培养管底部沉淀物进行涂片及抗酸染色镜检，判断是否为假阴性。

5. 统计学分析：应用SPSS 11.0进行数据处理，3种方法率的比较采用χ2检验，3种方法检出分枝杆菌时间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同培养方法的检出率比较

每份样本同时进行涂片镜检及3种方法分离培养，结果见表 l。3种不同培养方法共分离出261株分枝杆菌，检出率为49.6%(261/526)；其中M-MGIT法分离培养出256株，检出率为48.7%(256/526)；A-MGIT法分离培养出258株，检出率为49.0%(258/526)；L-J法分离培养出217株，检出率为41.3%(217/526)。M-MGIT和A-MGIT培养法检出率均高于L-J培养法，差异有统计学意义(χ2值分别为5.84和6.45，P值分别为0.018和0.013)，但M-MGIT和A-MGIT培养法检出率差异无统计学意义(χ2=0.02，P=0.951)。在146份涂片镜检抗酸杆菌阳性(涂阳)标本中，M-MGIT、A-MGIT和L-J 培养法阳性检出率分别为94.5%、93.8%和89.0%，差异无统计学意义(χ2=3.74，P=0.154)；在380份涂片镜检抗酸抗菌阴性(涂阴)标本中，M-MGIT(31.1%)、A-MGIT(31.8%)培养法检出率均高于L-J法(22.9%)，差异有统计学意义(χ2值分别为6.42和7.65，P值分别为0.014和0.007)；但M-MGIT与A-MGIT培养法的检出率差异无统计学意义(χ2=0.05，P=0.876)。

表1 526份痰标本的不同培养方法与痰涂片抗酸染色镜检检出结果比较

注括号内数值为构成比(%)

二、不同培养方法的阳性报告时间比较

M-MGIT法平均阳性报告时间为13 d[(13±6)d]，A-MGIT法平均报告时间为12 d[(12±6)d]，L-J法平均报告时间为24 d[(24±9)d]。M-MGIT和A-MGIT法阳性报告时间明显短于L-J法，差异有统计学意义(t值分别为15.84和18.32,P值均=0.000)，但M-MGIT和A-MGIT法之间的差异无统计学意义(t=1.89，P=0.071)。M-MGIT法51.2%(131/256)的培养阳性菌株和A-MGIT法52.7%(136/258)的培养阳性菌株的报阳时间在第2周内，而L-J法37.8%(82/217)的菌株报阳时间在第3周，35.5%(77/217)的菌株报阳时间在第4周。

三、不同培养方法的污染率比较

M-MGIT和A-MGIT培养法污染率分别为4.6%(24/526)和4.9%(26/526)，每份标本接种L-J培养基2支，共1052支，污染43支，污染率为4.1%，三者间差异无统计学意义(χ2=0.64，P=0.726)。

讨 论

BACTEC MGIT 960培养系统(A-MGIT)是一种全自动的、高通量的、非放射性的液体培养方法，MGIT培养管底部包埋有荧光物质，荧光物质将随着管内氧含量的变化而发生反应，若分枝杆菌在培养管中生长消耗氧，管内荧光物质被激活，在特定光源的激发下释放荧光，系统每小时监测培养管内的荧光强度一次，从而判断管内分枝杆菌生长情况[4]。 A-MGIT系统已经被证明是一种快速、简便，且敏感度较高的分枝杆菌培养系统[5-7]，但仪器价格昂贵，在基层结核病实验室可能无法推广应用。M-MGIT系统只需要普通的培养箱、底部包埋有荧光物质的4 ml MGIT培养管及荧光判读仪，设备小巧方便，适合基层实验室使用。两种培养系统的培养管均以7H9肉汤培养基为基础，加以专用的营养添加剂和杂菌抑制剂，两者在各成分的量上有所差别。

一般认为分枝杆菌培养法是诊断结核病的金标准，在我国各基层结核病实验室现在采用的培养法主要还是L-J法。但分枝杆菌在L-J培养基上生长缓慢，而在液体培养基中能快速生长[8]。本研究结果也显示，以液体培养基为基础的M-MGIT和A-MGIT两种培养系统对分枝杆菌的检出率(48.7%和49.0%)明显高于L-J培养法(41.3%)，差异有统计学意义，特别是在涂阴标本M-MGIT(31.1%)和A-MGIT(31.8%)的优势与L-J法(22.9%)相比更加明显，差异有统计学意义。潘爱珍、翁绳凤和李静等[9-11]也报道了M-MGIT培养方法较L-J培养法在分枝杆菌检出方面的优越性，并且与A-MGIT方法检出率差异无统计学意义。

对于未治疗患者，一般认为涂阳培阴率不应超过10%，而本研究中L-J法的涂阳培阴率达到11%，并且明显高于M-MGIT和A-MGIT法，可能因一些患者在确诊结核病之前在其他医院经过了广谱抗生素的治疗，致使结核分枝杆菌活力降低，再加上L-J培养基营养条件低于MGIT培养基，导致涂阳培阴率升高；也有可能因在标本液化和去污染过程中处理液加入的偏多，或时间没掌握好，处理时间偏长造成的。提示在今后工作中要注意掌握好处理液的量和处理时间。

在检出时间方面，由L-J法的平均24 d缩短至M-MGIT和A-MGIT法的13 d和12 d，差异有统计学意义，文献[9-11]也报道了在分枝杆菌检出时间方面M-MGIT法较L-J法更具有优势。并且两种液体培养基培养阳性的菌株分别有51.2%和52.7%在第2周内报告阳性，而L-J法37.8%的菌株在第3周内报阳，35.5%在第4周内报阳。两种液体培养方法与L-J法比较均显示了良好的检出效能，但M-MGIT与A-MGIT在检出率和检出时间上的差异无统计学意义。M-MGIT和A-MGIT法对分枝杆菌检出率高且时间短，可能与前两者的培养基成分和结果观察时间间隔有关。如：液体培养基的营养成分比L-J培养基丰富，并且其中加入了10%的CO2，由于宿主体内的实际环境为缺氧性，使用5%～10%的CO2可能刺激分枝杆菌原代培养物的初期生长[12]。另外，由于L-J法是1周观察1次结果，并且通过肉眼观察，而M-MGIT和A-MGIT培养结果观察通过紫外线检测荧光强度判断阳性，其结果判定更敏感，且M-MGIT法是每天监测结果，A-MGIT法是每小时监测结果1次，这些因素可能对M-MGIT、A-MGIT与L-J法在检出时间上的差异产生影响，提示这两种MGIT液体培养基比传统L-J法快速、敏感。

本研究中，M-MGIT和A-MGIT培养法污染率分别为4.6%和4.9%，L-J培养法污染率为4.1%，三者差异无统计学意义。污染率控制在我国规范标准2%～5%[3]之内，污染率低于Satti等[5]和 Rodrigues等[6]报道的污染率，但高于Somoskövi等[13]报告的污染率。各研究之间污染率差异很大，可能由于各实验室的痰标本质量、痰留存时间及运输条件、实验室条件各不相同造成。

要确定分离出的分枝杆菌是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌还需进行菌种鉴定, 培养阳性的分枝杆菌中可能存在抗酸染色阳性的非结核分枝杆菌。本研究不足之处是由于本实验室条件有限，未能对菌株进行菌种鉴定, 未对M-MGIT检出非结核分枝杆菌的能力进行分析。

总之，M-MGIT法对分枝杆菌的检出能力明显优于L-J法，与A-MGIT法相当。但M-MGIT法的荧光判读仪价格(8万元人民币左右)远低于A-MGIT法的BACTEC MGIT 960系统(130万人民币左右)，因此，M-MGIT方法较A-MGIT和L-J方法在检出分枝杆菌方面更具优势，在基层结核病实验室具有较好的应用前景。

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