非白色假丝酵母菌代谢产物对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞增殖的诱导作用

陈斌 车团结 白德成 何祥一

[摘要] 目的 研究3种常见的非白色假丝酵母菌对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞增殖及细胞周期的影响。方法 制备热带假丝酵母菌、克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌上清液并行倍比稀释，设1、4、16倍3个稀释度以及对照组。体外培养ECV304细胞，分别将3种非白色假丝酵母菌不同稀释度的上清液与ECV304细胞共培养，采用MTT法测定培养24、48、72 h后的细胞增殖率；倒置显微镜观察培养48 h后细胞密度的变化；流式细胞术测定培养48 h后对ECV304细胞周期的影响。结果 培养24 h后，3种假丝酵母菌1倍稀释的上清液均可促进细胞增殖，4倍稀释的克鲁斯假丝酵母菌也可促进细胞增殖（P<0.05）；培养48、72 h后，克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌上清液仍可促进ECV304细胞增殖，而热带假丝酵母菌上清液无论稀释度高低均不能促进ECV304细胞增殖。培养48 h后，克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌上清液组的细胞密度明显增高，同时其G0/G1期细胞所占比例降低，细胞增殖指数（PI）升高（P<0.05）；而热带假丝酵母菌组的细胞密度和PI均无明显变化（P>0.05）。结论 克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌的代谢产物对ECV304细胞的增殖有诱导作用，临床上应加强非白色假丝酵母菌感染的检测和治疗。

[关键词] ECV304细胞； 非白色假丝酵母菌； 增殖； 代谢产物

[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.018

假丝酵母菌（Saccharomyces）是一种条件致病菌，常分布在人体的肠道、泌尿道、皮肤和口咽黏膜等处。当宿主存在营养摄入不足、免疫力降低，以及长期配戴义齿等诱发因素时，易引起口腔黏膜感染假丝酵母菌，发生口腔假丝酵母菌病[1-2]。近年来，

随着免疫抑制剂、细胞毒性药物、广谱抗生素的广泛应用，器官移植术及导管介入等各种治疗方法的开展，以及获得性免疫缺陷综合征、糖尿病、恶性肿瘤等疾病患病率的升高，由此导致的宿主免疫功能低下或菌群失调人群的增多，使得口腔假丝酵母菌感染率迅速上升[3-4]。在能引起人类感染的假丝酵母菌中，白色假丝酵母菌（Saccharomyces albicans）

是最主要、最常见的致病菌[3，5]；但是，近年来假丝酵母菌病的致病菌谱有所变迁，由非白色假丝酵母菌引起的感染不断增加。

本课题组前期研究[6]表明：白色假丝酵母菌的代谢产物是重要的致病成分，可引起人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖。为进一步探讨非白色假丝酵母菌在口腔中的致病作用，本研究采用3种常见的非白色假丝酵母菌代谢产物与体外培养的ECV304细胞共培养，观察其对细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

热带假丝酵母菌（Saccharomyces tropicalis）ATCC 750、克鲁斯假丝酵母菌（Saccharomyces krusei）ATCC 6258、光滑假丝酵母菌（Saccharomyces glabrata）CC-UG 32725，由芬兰赫尔辛基大学口腔医学研究院惠赠。人脐静脉内皮细胞株ECV304购自中国科学院上海药物研究所。MTT（Sigma公司，美国）；RPMI 1640培养液（Gibco公司，美国），胎牛血清（杭州四季青

生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（Gibco公司，美

国）。

1.2 方法

1.2.1 假丝酵母菌上清液的制备 3种假丝酵母菌在37 ℃沙堡氏液体培养基中振荡培养48 h后，用高压灭菌PBS稀释各菌液，至OD600为1.00±0.05时，将菌液置于7 000 r·min-1、4 ℃条件下离心20 min。取上清液，采用0.22 μm滤膜过滤除菌，超声破碎，再用0.22 μm滤膜二次过滤除菌后得到假丝酵母菌上清液，备用。

1.2.2 实验分组 实验组：热带假丝酵母菌组、克鲁斯假丝酵母菌组和光滑假丝酵母菌组的上清液分别用PBS倍比稀释，设1、4、16倍共3个稀释度。对

照组：3组加入等量PBS。

1.2.3 ECV304细胞传代培养 复苏冻存的ECV304细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，在37 ℃、5%CO2、95%空气及饱和湿度条件下培养。当细胞长满瓶壁的75%以上时传代，收获指数生长期的ECV304细胞，备用。

1.2.4 ECV304细胞增殖率的测定 用完全培养液调整细胞密度至每毫升1×105个，接种于96孔板，每孔100 μL。培养24 h待细胞完全贴壁进入对数生长期后，将热带假丝酵母菌、克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌倍比（1、4、16倍）稀释的上清液10 μL分别加入细胞培养孔中，每孔10 μL；对照组加入PBS，每孔10 μL。分别培养24、48、72 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT 10 μL，继续培养4 h后，每孔加入10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS）液120 μL，置于培养箱中培养12 h后，置于酶联免疫检测仪上测定570 nm处的吸光度A值。每组设5个平行孔，实验重复3次。细胞增殖率（%）=（实验组A值-对照组A值）/对照组A值×100%。

1.2.5 ECV304细胞密度的变化 将ECV304细胞制成密度为每毫升5×104个细胞的细胞悬液，接种在6孔板中，每孔2 mL，培养24 h后每孔分别加入200 μL 1倍稀释的热带假丝酵母菌、克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌的上清液，以等体积PBS作为对照。继续培养48 h后在倒置显微镜下观察ECV304细胞密度的变化。

1.2.6 ECV304细胞周期的变化 用完全培养液调整ECV304细胞密度为每毫升5×104个，每瓶加入10 mL细胞悬液，培养24 h，待细胞贴壁进入对数生长期后，更换完全培养液，分别加入1 mL 1倍稀释的热带假丝酵母菌、克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌的上清液。另设加入1 mL PBS的组为对照组。每组设3个平行。继续培养48 h后，2.5 g·L-1胰酶消化收集细胞，采用流式细胞仪检测细胞DNA的周期性变化，分析各组G0/G1期、S期、G2/M期细胞的百分数，并计算细胞的增殖指数（proliferation index，PI）。PI（%）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

1.2.7 统计学分析 应用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，结果采用x±s表示，分别对各实验组进行单因素方差分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 非白色假丝酵母菌上清液对ECV304细胞增殖作

用的影响

不同稀释度的3种非白色假丝酵母菌上清液作用ECV304细胞不同时间后，对ECV304细胞增殖作用的影响见表1、2。作用24 h时，3种假丝酵母菌1倍稀释的上清液作用EVC304细胞均可促进细胞增殖，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；4倍稀释时，仅有克鲁斯假丝酵母菌上清液可以促进细胞增殖，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；16倍稀释时，3种菌均无促细胞增殖作用，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。

作用48 h时，与对照组相比，克鲁斯假丝酵母菌所有稀释度的上清液均可促进细胞增殖（P<0.01）；光滑假丝酵母菌上清液在1倍和4倍稀释时，可明显促进细胞增殖（P<0.05），但在16倍稀释时无明显作用（P>0.05）；而热带假丝酵母菌3种稀释度的上清液对细胞促增殖作用均不明显（P>0.05）。

作用72 h时，光滑假丝酵母菌各稀释度上清液均可促进ECV304细胞增殖，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；克鲁斯假丝酵母菌上清液在1倍和4倍稀释时，可明显促进细胞增殖，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01），但在稀释16倍时无

明显促增殖作用（P>0.05）；热带假丝酵母菌3种稀释度的上清液均无明显的促增殖作用，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。

细胞增殖率结果显示：克鲁斯假丝酵母菌1倍和

4倍稀释的上清液，以及光滑假丝酵母菌1、4和16倍稀释的上清液都是在培养72 h时促细胞增殖的作用最强。

2.2 非白色假丝酵母菌上清液对ECV304细胞密度变

化的影响

ECV304细胞经3种假丝酵母菌上清液处理48 h后的细胞密度见图1。与对照组（图1a）相比，热带假丝酵母菌上清液组（图1b）的细胞密度无明显变化；克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌上清液组（图1c和图1d）的细胞密度明显高于热带假丝酵母菌上清液组

与对照组。

2.3 非白色假丝酵母菌上清液对ECV304细胞周期的

影响

3种非白色假丝酵母菌上清液在作用ECV304细胞48 h后，各组细胞周期时相的测定结果见表3。与对照组相比，3个实验组S期细胞所占比例均升高；克鲁斯假丝酵母菌组和光滑假丝酵母菌组G0/G1期细胞所占比例较对照组均降低，而反映细胞增殖活力的指数PI均升高；上述差异均有统计学意义（P<0.05）。

热带假丝酵母菌组G0/G1期细胞所占比例和PI与对照组相比均无明显变化（P>0.05）。

3 讨论

假丝酵母菌是口腔常见的共生菌，在健康人群中的检出率将近50%[7]。但是有学者[8]认为口腔假丝

酵母菌感染与肿瘤的发生发展密切相关。9%～40%的口腔癌症患者可并发假丝酵母菌白斑，而其中2%～6%的白斑可发生恶变[9]。研究[10]证实：侵入的口腔假丝酵母菌能引起口腔上皮的增生。Barrett等[11]认

为：假丝酵母菌感染与中、重度上皮增生甚至恶变密切相关。有学者[12]利用口腔假丝酵母菌与口腔上皮细胞共培养，发现假丝酵母菌可引起口腔上皮细胞的细胞周期发生改变， 细胞增殖活力升高。

肿瘤的发生发展不仅仅取决于口腔黏膜上皮细胞，也与口腔黏膜下血管内皮细胞密切相关。血管内皮细胞能快速增生、迁移形成肿瘤新生血管，是肿瘤血管生成的靶细胞，可以为肿瘤的发展运输养分并排出代谢产物；此外，新生的血管内皮细胞可以分泌某些生长因子以促进肿瘤细胞的生长与移动。肿瘤的增长速度在很大程度上取决于营养的供应。当肿瘤体积超过2 mm3左右时，已不能单纯依靠弥散方式获取氧气及营养物质，此时若无新生毛细血管长入，肿瘤组织将处于休眠状态或发生退化[13]。

目前已有研究[14]从体外实验和动物实验等方面

探讨了白色假丝酵母菌的致病潜力，认为该菌是最常见、致病性最强的一种口腔假丝酵母菌。本课题组前期研究[6]显示：白色假丝酵母菌代谢产物可引起

ECV304细胞的增殖，是重要的致病成分。有研究[8，15]发现：白色假丝酵母菌与口腔肿瘤的发生发展密切相关。同时，非白色假丝酵母菌例如光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克鲁斯假丝酵母菌等也是主要的致病菌[16]。近年来，致病性假丝酵母菌的菌谱

有所变迁，即由非白色假丝酵母菌引起的感染不断增加，而针对非白色假丝酵母菌代谢产物致病性的研究还较少。ECV304细胞是通过分离健康产妇正常娩出的胎盘游离端脐带的脐静脉得到的永生血管内皮细胞株，早在1984年国外已有学者应用其进行感染菌与宿主细胞交互作用方面的实验探索[17]。

本研究结果显示：利用非白色假丝酵母菌上清液与细胞共培养，在不同培养时间（24、48、72 h）

和不同稀释度作用下，3种非白色假丝酵母菌上清液促进ECV304细胞增殖的作用有所不同。短时间（24 h）作用后，3种菌的1倍稀释上清液以及克鲁斯

假丝酵母菌的4倍稀释上清液可促进细胞增殖。长时间（48、72 h）作用后，高稀释度的克鲁斯假丝酵母菌上清液（16倍稀释，48 h）和光滑假丝酵母上清液（16倍稀释，72 h）仍有促进ECV304细胞增殖的作用，而热带假丝酵母菌上清液无论稀释度高低均不能促进ECV304细胞增殖；细胞增殖率结果显示：克鲁斯假丝酵母菌1倍和4倍稀释的上清液，以及光滑假丝酵母菌1、4和16倍稀释的上清液都是在培养72 h时促细胞增殖的作用最强。

高稀释度的克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌在长时间作用细胞后仍可促进细胞增殖这一结果，与本课题组前期对白色假丝酵母菌的研究结果[6]有

所不同，提示克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌的代谢产物可能不同于白色假丝酵母菌，前两种菌的代谢产物能分解或转化成促细胞增殖作用更大的毒性物质。该结果提示临床上对于假丝酵母菌长期慢性感染的患者，更应注重克鲁斯假丝酵母菌和热带假丝酵母菌的防治和监测。

增殖旺盛的细胞处于S期和G2/M期的比例较高。本研究结果显示：克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌上清液组G0/G1期细胞所占比例均降低，而反映细胞增殖活力的指数PI均升高；热带假丝酵母菌组则无明显变化。这说明克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌上清液可促进细胞增殖，而热带假丝酵母菌上清液的促增殖作用不明显。

有研究[18]显示：肿瘤血管内皮细胞的表型及功

能特性与正常静止的血管内皮细胞具有明显差异，肿瘤血管内皮细胞呈不成熟及快速分裂状态，与正常组织的血管内皮细胞相比，其增殖活性可增高20～

2 000倍。本研究结果说明：除了最常见、致病性最强的白色假丝酵母菌以外，克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌的代谢产物也可诱导口腔黏膜上皮深层的血管内皮细胞增殖，促进口腔肿瘤的发生和发展。控制口腔假丝酵母菌感染，首选氟康唑、伊曲康唑等药物，但是假丝酵母菌对此类药物特别是氟康唑耐药性的增强，已越来越引起关注[3]。近年来，非白色假丝酵母菌引起的感染不断增加，而且克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对此类抗真菌药并不敏感[2]。在进行白色假丝酵母菌相关研究的同时，也要重视对非白色假丝酵母菌特别是克鲁斯假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌致病机理的研究和新型特异性药物的研制，加强临床上非白色假丝酵母菌感染的检测和治疗。

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（本文编辑 吴爱华）