纳米抗菌复合膜的结构及作为引导骨组织再生膜的生物相容性研究

刘曼 张强 周立伟 莫安春 李小玉 李吉东

[摘要] 目的 观察载银纳米羟磷灰石/二氧化钛/聚酰胺66（Ag-nHA-nTiO2/PA66）纳米抗菌复合膜的物理结构及对成骨样细胞生物相容性的影响。方法 扫描电镜（SEM）和光学显微镜下观察Ag-nHA-nTiO2/PA66膜和膨体聚四氟乙烯（e-PTFE）膜的结构，在两组膜材料上接种成骨样细胞MG63，另设空白对照组。甲基噻唑基四唑（MTT）法检测MG63细胞的增殖曲线，酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶（ALP）的表达，SEM下观察细胞在生物膜表面的增殖和黏附情况。结果 Ag-nHA-nTiO2/PA66膜正面疏松多孔，反面光滑致密。e-PTFE膜正反面结构相同，由成行排列的长椭圆形裂隙组成。与空白对照组相比，MTT检测显示，两种膜对MG63细胞增殖活力差异无统计学意义（P>0.05）；ALP活性间差异也无统计学意义（P>0.05）。SEM下观察细胞在两种膜上生长良好，在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜上细胞伸展更充分。

结论 Ag-nHA-nTiO2/PA66膜对MG63细胞生长无抑制作用。与e-PTFE相比，其具有更优良的结构和生物学性能，适于用作引导骨再生膜材料。

[关键词] 引导骨再生； 羟磷灰石； 银； 成骨样细胞MG63

[中图分类号] R 783.1 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.004

引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）生物膜技术在口腔医学领域中发挥重要的作用。载银纳米羟磷灰石/二氧化钛/聚酰胺66（Ag-nHA-nTiO2/

PA66）纳米抗菌复合膜是将无机纳米复合抗菌材料

载银纳米羟磷灰石/纳米二氧化钛（Ag-nHA-nTiO2）和聚酰胺66（PA66）复合，采用“常压共溶法”制备而

成的。在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜中的nTiO2和Ag+含量分别为0.48%和2.35%。前期实验已证实其对口腔常见细菌具有良好的抗菌性[1]。但是，对于该膜的结构及生物相容性尚缺乏研究。因此，本实验以膨体聚四氟乙烯（e-polytetra fluoroethylene，e-PTFE）膜为对照，通过光镜和扫描电镜（scanning electron mi-

croscope，SEM）对比观察Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌

膜的结构，并在两种膜上接种成骨样细胞株MG63，观察MG63在膜上的生物学活动变化，探讨Ag-nHA-nTiO2/PA66膜作为GBR膜的生物相容性。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

e-PTFE膜（上海塑料研究所第一研究室），Ag-

nHA-nTiO2/PA66膜（四川大学纳米生物材料中心），

SEM（JSM-5900，JEOL公司，日本），IX70倒置相差显微镜（OLYMPUS公司，日本）等。

1.2 膜材料结构观察

将Ag-nHA-nTiO2/PA66膜和e-PTFE膜剪裁成

1 cm×1 cm方片，制作石蜡切片，厚5 μm，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，倒置显微镜观

察膜横截面的结构。取两种膜材料裁成同样大小，真空干燥，喷金，采用SEM观察膜的表面情况。

1.3 膜上成骨样细胞生长曲线的测定

将e-PTFE膜和Ag-nHA-nTiO2/PA66膜剪裁成直径为14 mm的圆片各12张，消毒后PBS液清洗3次，置于24孔培养板内，另设空白对照组。按照细胞密度为每孔3×104个进行接种，标准环境下进行孵育（37 ℃，95%空气，5%CO2），分别于1、3、5、7 d各取出3孔，用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetra-

zolium，MTT）法，在570 nm波长下测定每孔的光密度（optical density，OD）值，每组每次取得3孔的数

值，计算各组平均值，采用双因素方差法分析结果。

1.4 细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活

性测定

将e-PTFE膜和Ag-nHA-nTiO2/PA66膜剪裁成直径为34 mm的圆片各12张，消毒后PBS液清洗3次，置于6孔培养板内，另设空白对照组。培养板内按照细胞密度为每孔6×105个接种MG63，标准环境（37 ℃，95%空气，5%CO2）下进行培养，分别于1、3、5、7 d各取出3孔，收集细胞，在酶联免疫检测仪上测定各孔OD值，测定细胞内ALP活力。

1.5 细胞黏附和增殖情况

细胞培养同1.4。分别于1、5 d取出膜片各3个，3%戊二醛固定，梯度脱水，醋酸异戊酯浸泡20 min。临界点干燥，喷金，SEM下进行观察。

2 结果

2.1 膜材料结构观察结果

2.1.1 倒置显微镜下观察结果 HE染色后e-PTFE膜的横截面结构比较均匀一致，正、反面都可见较长的裂隙，约30～50 μm，裂隙之间相互交通。正、反面都比较平滑，孔隙大小约为15 μm（图1左）。Ag-

nHA-nTiO2/PA66膜的横截面可见大小不等、形状各异的孔隙相互连通。正面结构疏松，孔隙大小约50～300 μm，从正面到反面的横截面中可见到300 μm的大孔隙；反面约有50 μm的孔隙，十分致密（图1右）。

2.1.2 SEM下观察结果 e-PTFE膜可见成行排列、直径不一的长椭圆形裂隙，长约5～20 μm，宽约3 μm，正、反面结构基本一致（图2）。Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜的正面疏松多孔，由大小不等的孔隙构成，孔隙大小从几微米到上百微米不等，孔隙的形状各异，大孔隙之间相互通连，其中又有许多小的孔隙，有的孔隙中可见到一些颗粒状的沉积物。反面比较平滑，孔隙的大小为1～10 μm，孔隙形状多为圆形，孔隙之间未见交通（图3）。

Fig 3 Surfaces of Ag-nHA-nTiO2/PA66 membrane SEM × 2 000

2.2 MG63细胞在两种膜上的生长情况

2.2.1 细胞增殖曲线的测定 分别在1、3、5、7 d测定两种膜组和空白对照组的OD值，计算其相对时间点上的均值，绘制细胞增殖曲线（图4）。统计学分

析表明，3组细胞增殖量组间差异无统计学意义（P>0.05），每组在时间点上的数据两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），第1天到第7天逐步增高。

2.2.2 细胞ALP活性的测定 将收集的细胞反复冻融2次后，测定3组不同时段的ALP活性。随着时间的增加，每组ALP活性均有所增加。统计学分析表明，每组细胞ALP活性第3天与第5天间差异无统计学意义，其余各时间点差异均有统计学意义（P<0.05）。而3组间的ALP活力差异无统计学意义（P>0.05）（图5）。

2.3 细胞在膜上黏附和增殖的SEM观察

2.3.1 细胞在e-PTFE膜上的黏附和增殖情况 膜上接种MG63细胞第1天，SEM下观察到细胞零星的分散在膜上，细胞呈长梭形，伪足伸展长短不一，胞核清楚，胞浆丰富（图6左）。膜上接种MG63细胞第5天，SEM下观察到细胞呈片状分布在膜上不同的区域，多个细胞相互交联，细胞生长良好，细胞伪足伸展不充分，未见细胞伸入到空隙中（图6右）。

2.3.2 细胞在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜上的黏附和增殖情况 膜上接种MG63细胞第1天，SEM下观察到细胞黏附在孔隙的边缘和中间，形态有长梭形，伪足伸展良好，细胞形态多样，细胞伸出的伪足黏附在孔隙的表面和孔隙中（图7左）。

接种MG63细胞第5天，SEM下观察到细胞已经长在膜表面，呈片层状，细胞有长条形、梭形，形态各异。有的细胞两端跨越孔隙，有的黏附在孔隙的边缘，细胞生长良好，细胞相互交通（图7右）。

3 讨论

1982年Nyman等[2]在牙周病的治疗中提出引导性组织再生（guided tissue regeneration，GTR）。其基

本原理是：不同组织细胞向创口内生长或迁移速度不同，局部植入人工生物引导膜，利用膜屏障建立一个能使生物再生功能得到最大程度发挥的有利环境[2]。骨组织是以再生方式完成损伤修复的少数组织

之一，GTR概念同样适用于骨再生过程即GBR。目前，GBR技术已广泛应用于口腔种植修复领域。

在GBR的操作以及后期使用中经常出现膜暴露、创口感染等问题，严重影响GBR成功率[3]，开发具备

抗菌性能的GBR膜尤为重要。但是，很多材料在抗菌的同时也会对正常组织细胞造成抑制甚至造成正常细胞死亡。因此，在探讨膜的抗菌性能时，更为重要的是确认膜的生物相容性。本实验中使用的抗菌Ag+即是广泛被用作抗菌作用的有效成分，笔者的前期研究也证实Ag-nHA-nTiO2/PA66具有良好的抗菌性能，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌率分别为50.10%和56.31%，而对牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌和具核梭杆菌的抗菌率分别为91.84%、90.49%和90.64%[1]。这同其他研究结果类似，即Ag+具有一定的抗菌性能[4]。但是既往研究同时表明：当Ag+浓度较高时对真核细胞会产生毒性，从而抑制细胞活力[5]。Chung等[6]对Ag+的生物相容性进行检测，发现Ag+对细胞的活力有抑制作用。本实验抗菌复合膜中起抗菌作用的主要成分也是Ag+。因此，本实验对新开发的Ag-nHA-nTiO2/PA66复合膜进行了生物相容性方面的研究。结果显示，对比e-PTFE膜，载Ag+复合膜上，MG63细胞伸展良好，细胞伪足深入空隙且互有交通。细胞增殖曲线显示细胞增殖活性不受抑制。ALP检测结果显示细胞功能良好，成骨能力未受Ag+的影响。由此可见，抗菌复合膜Ag+浓度适宜，不会抑制细胞生长。说明Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜生物相容性良好。

体外细胞复合培养法简便、敏感、重复性好，已经成为评价生物材料相容性的重要手段[7]。成骨细

胞是一种特殊的成纤维细胞，在骨改建中具有关键性作用，成为骨代谢研究中的重要部分。采用体外培养的人成骨细胞可评价材料的生物相容性，并且准确的反映材料对机体的影响。本研究选用的成骨样细胞株MG63具有多次传代后仍能保持稳定细胞表型的特性；同时成骨样细胞株与普通成骨细胞表型接近，在很多成骨相关的研究中都采纳成骨样细胞株作为研究对象[8]。本实验选择成骨样细胞株MG63

作为研究对象，由SEM及ALP表达情况来看，细胞生物学形态及功能表达良好，说明实验中MG63性状和表达稳定，实验结果可靠。

引导膜的结构及其生物相容性在GBR生物膜技术中发挥着关键作用。该膜既要允许营养通过，又要求能隔离周围结缔组织细胞长入。既往研究表明：理想的膜支架材料应有较高的孔隙率和孔隙贯通率，以及适于骨组织生长的力学支撑[9]。当孔径在150 μm以上，则是骨组织长入的理想场所。本实验中e-PTFE膜结构均一，最大孔径在20 μm以内；Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜则存在正反面的结构，正面孔径可达上百微米，而反面孔径最大不超过10 μm。细胞学实验可见：e-PTFE膜上细胞可黏附但无深入生长，而Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜上MG63细胞生长良好，且细胞伪足深入孔内。由此说明，相比较e-PTFE膜，Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜更具有优势，其双层结构在为成骨细胞提供支架的同时，致密一面可以阻止软组织长入，而疏松的一面则有利于新骨组织的生成。

本实验通过观察Ag-nHA-nTiO2/PA66膜的结构以及MG63细胞在其上的生长、表达情况，发现Ag-nHA-nTiO2/PA66膜对MG63细胞的生长无抑制作用，MG63细胞在其组织面上黏附效果好，能够充分生长和增殖。综上所述，Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌复合膜具有优良的结构及生物相容性，具有作为GBR膜的可行性。当然Ag-nHA-nTiO2/PA66膜是否能成为优良的GBR膜，还需进一步深入研究。

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（本文采编 石冰）