器械清洗酶相容性研究

马清河，薛 刚，秦艳梅，刘丽娜

（河北省科学院微生物研究所，河北 保定 071051）

清洗剂类产品借助酶，其低温、节能、省时、节水和安全、无害的性能获得了全面提升。目前含有多种酶的清洗剂在器械的清洗上开始被广泛采用，但市场上的含酶器械清洗剂质量、标准均不一致［1］，尤其是多酶种类的采用，很少有对其各酶之间的相互影响进行深入研究，而很多研究［2］、［3］指出，必须解决各酶制剂一致性的问题，否则不同酶的适用条件会造成酶混合后相互影响的矛盾，有可能会降低了其应用价值，难以得到推广应用。本实验利用对清洗有效果的淀粉酶（amylase）、蛋白酶（proteinase）［4］进行配伍，通过对二者的相容性、稳定性等方面的考察，为器械清洗合理用酶提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）主要材料：医用摄子、止血钳、剪刀、手术刀、柄，为市售。枯草芽孢杆菌（Bacillas subtilis）产的淀粉酶（2000u／g）和蛋白酶（80000u／g），为本实验室保存。

（2）主要试剂：3，5－二硝基水杨酸，葡萄糖，3，5－二硝基水杨酸（DNS）显色液，碘化钾、二氯化汞、氢氧化钾、氯化铵、酒石酸钾钠、甲醛、L－谷氨酰胺均为分析纯。

（3）主要仪器：SP－721E分光光度计 上海光谱仪器有限公司；202型恒温培养箱 余姚市东方电工仪器厂；H－4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；ZDX－35D高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；78－1型磁力搅拌器 上海一恒科学仪器有限公司；FA2004N型电子分析天平上海精密科技仪器有限公司；E－201－C型pH计 上海精科实业有限公司。

1.2 方法

（1）酶的配伍：按淀粉酶活力（u／g）：蛋白酶活力（u／g）分别为1∶3、1∶9、1∶15、1∶21、1∶27分别复配，均用蒸馏水稀释200倍，于5000r／min冷冻离心15min，取上清液在40℃中保存备用。

（2）酶活力测定：参照文献［5］中的“紫外光分光光度法”进行。

（3）两酶配伍后的相容性考察：取上述（1）中不同活力比值配伍的混合酶液各100mL于比色试管内，用0.2M的磷酸盐缓冲溶液调整各混合液pH＝7.0后，把各试管置于320℃的恒温震荡水浴锅内30min、60min、120min，分别取出观察各试管有无分层、有无沉淀和浑浊等现象。

（4）两酶配伍后的稳定性考察：取上述（1）中不同活力比值配伍的混合酶液各100mL于比色试管内，在其自然pH值状态下，置于300℃恒温箱内，在15d、30d、60d、90d定期测定各酶的活力、观察各试管有无沉淀和浑浊现象。

（5）蛋白污垢的清除能力：医用器械在人为污染血液后，自然状态下放置24h。取上述（1）中不同活力比值配伍的混合酶液各300mL于小托盘内，用0.2M的磷酸盐缓冲溶液调整各混合液pH＝7.0后，放置在300℃的恒温震荡箱中预温5min，然后把污染的摄子、止血钳、剪刀、手术刀等医用器械放入浸泡10min。测定各液的蛋白质含量增加率，用清水代替上述各混合酶液做对照。

2 结果

（1）配伍后混合酶液的活力表征：上述1.2（1）中不同活力比值配伍的混合酶液中各酶的活力如下表1。

表1 混合酶液中各酶的活力（u／mL）

（2）复配后各酶之间的相容性：在初始30min至60min内，各试管中的混合酶液均为浅黄色液体，透明无分层，无沉淀；120min开始，除1∶27酶活力比值的试管外，其它试管均有浑浊的现象产生，1∶3酶活力比值的试管出现微量沉淀。

说明蛋白酶与淀粉酶在混合后的液体状态下，处于适宜的温度和时间中，均会产生相互影响；而适宜的配比活力比值能使酶之间的相容性提高。

（3）复配后混合酶液的稳定性：不同时间段各酶活力值见下表2。

表2 各时间段混合液中两酶的活力值（u／mL）

表2可以看出，在液态中不论是何种酶，没有加入稳定剂的情况下，长、短时间的放置其活力均下降；两酶活力比值较大时，混合后的酶液稳定性较好；两酶活力比值较小时，混合后的酶液稳定性较差。

从混合酶液外观上，放置15d至60d左右，各混合酶液均产生浑浊，甚至有絮状沉淀，而仅有个别的1∶27活力比值的混合酶液表现出微小的浑浊并保持了较好的透明无分层；90d后各混合液浑浊现象减轻趋于清澈、透明，但沉淀增加。

说明蛋白酶对蛋白（淀粉酶就是活性蛋白）的作用是会必然发生的，环境条件（如状态、温度…）决定了作用的大小和快慢；混合酶液存放比单一酶液存放更易失活和变质，但同时适宜的活力比值混合，反而能促进淀粉酶与蛋白酶的配伍稳定性。

（4）不同活力比值混合酶液对蛋白污垢的清除能力：各混合酶浸液中蛋白质含量增长情况见下图1。

图1 各混合液中蛋白质的吸光度

从图1可以看出，各混合酶液蛋白质的吸光度大小顺序为清水＜1∶15＜1∶3＜1∶21＜1∶9＜1∶27。

说明淀粉酶和蛋白酶的混合液，对器械上蛋白污垢的去除能力并不和酶相对活力的大小呈正比，而是以适宜的混合活力比值有关。

3 讨论

器械清洗剂中所含有的蛋白酶，会和淀粉酶及任何其它酶发生相互作用，其作用只是因条件因素而决定，如在本实验中的淀粉酶和蛋白酶的混合酶液，在较低温度与短时间内，没有发生浑浊和沉淀现象，液体呈清澈透明状，但并不说明蛋白酶不会与淀粉酶作用；在较高（适宜）的温度和较长时间，该混合液均产生絮状沉淀及浑浊，即说明发生了相互作用现象。而器械清洗酶产品的使用均会在较高的温度条件下进行［6］，因此建议在研发类似混合酶产品时，应以使用条件（如温度）来考察酶之间的相容性。

多酶混合时，其各酶之间的配比浓度对其性能影响显著［7］的观点已得到共识，并在本实验结果中也得到很好的论证。

通过本实验可以看出，液体中，多酶混合后的稳定性在大多情况下较单一酶要小。但本实验中淀粉酶和蛋白酶活力比值越大，混合后的相容性及稳定性越高，其机理需进一步的研究。

［1］ 陶西萍，薛卫宁，高艳霞.多酶清洗剂清洗效果简易检测方法［J］.中国消毒学杂志，2011，28（6）：758－759.

［2］ E.Csiszar A.Losonezi B.Koezka，G.Szaka－csA.Pomlenyi.Degradationoflignin－eont－aini ngmaterialsbyxylanaseinbio Pre Parationofcotton［J］.BioteehnolLett，2006，（28）：749－753.

［3］ Moussa K.Traore，Gisela Buschle Z Diller.Environmally Friendly Seouring Proeesses［J］.TEXTILECHEMISTANDCOLORIST＆ AMERICAN DYESTUFFREPORT，2000，32（12）：40－43.

［4］ 姜锡瑞，段钢.新编酶制剂实用技术手册［M］.北京：中国轻工业出版社，2002.

［5］ 郭勇 酶工程［M］.北京：中国轻工业出版社，2004.

［6］ 石艳燕 多酶清洁剂与数控超声波在清洗口腔小器械中的应用［J］.华医院感染学杂志，2011，21（19）：4173.

［7］ 肖怀秋等 双酶协同作用对大豆分离蛋白酶解的影响［J］.中国酿造，2008，（11）：28－29.