三种葡萄病毒的RT—PCR检测和系统进化分析

王建辉 刘建军等

摘 要： 【目的】为了研究不同葡萄病毒病快速检测方法和四川分离株系统进化，【方法】比较3种葡萄总RNA提取方法，还优化了葡萄病毒病的RT-PCR检测方法。分别克隆了3种病毒四川分离株的部分基因组区域，并开展了系统进化分析。【结果】结果表明，改进硅胶颗粒吸附法快速从葡萄枝条的韧皮组织中提取了总RNA，并以葡萄18S RNA为内参基因，RT-PCR分别成功扩增出3种病毒的目的片段。把16个地理起源的GLRaV-2分离株的外壳蛋白基因（Coat protein， CP）分成5个系统进化组。而7个地理起源的GVB分离株CP同源性为79.1%～98.7%。此外，5个GVA四川分离株分别位于系统进化树的4个聚类群。【结论】GLRaV-2、GVB和GVA不同地理起源的分离株在核酸水平上具有变异性，其中GVA四川分离株之间具有显著的遗传差异，可能包括4种株系。

关键词： 葡萄卷叶伴随2型病毒； 葡萄B病毒； 葡萄A病毒； 病毒外壳蛋白基因； 病毒沉默抑制子基因

中图分类号：S663.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0197-05

葡萄是一种在全世界栽培面积大、产量高的重要果树。带毒种苗与昆虫介体的传播造成了葡萄病毒病在全世界广泛流行，严重地影响葡萄产量和品质[1-2]。葡萄可被多种RNA病毒感染并产生不同症状。葡萄卷叶伴随2型病毒（Grapevine leafroll associated virus-2， GLRaV-2）与砧木嫁接不亲和症状有关。GLRaV-2种群分为5个系统进化组，各个变异组内的分离物具有不同致病性[3]。葡萄B病毒（Grapevine Virus B， GVB）是葡萄粗皮病的主要病原物，GVB种群也包含多种变异株[4]。葡萄A病毒（Grapevine virus A， GVA）与皱木复合病有密切关系，包含了系统进化I、II、III组的变异株系[5]。

近年来，全国葡萄种植新区的建立和栽培面积的扩大，不同品种的扦插苗在各地的引进和输出也日益频繁，不科学的栽培技术，被感染种苗的扩散和带毒昆虫的传播，造了成各种葡萄病毒病在四川、山东、湖北等地的发生[6-8]。本文进一步优化了葡萄总RNA提取方法和3种葡萄病毒病RT-PCR快速检测技术，并分别克隆了GLRaV-2、GVB和GVA四川分离株的部分基因组序列。利用核酸数据库（NCBI）已知分离物核酸序列，分别开展了3种病毒的系统进化研究。开展葡萄病毒RT-PCR快速检测与病毒系统进化研究，以期为葡萄无病毒苗木生产与葡萄病毒病防控提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

在四川省欧美杂交鲜食葡萄（Vitis vinifera L.×V. labrusca L.）主产区分别采集‘京早晶与‘藤稔的1 a生成熟枝条，开展枝条韧皮部为材料提取总RNA研究。另外，‘藤稔（1株）、‘无核王子（2株）、‘希姆劳特（1株）、“南抗一号”（1株），用于GVA遗传多样性研究。

1.2 DAS-ELISA检测与Western blot杂交

DAS-ELISA检测试剂盒购自意大利Agritest ，参考试剂盒说明检测GLRaV-2、GVB和GVA，待测样本OD405吸收光值是阴性对照的3倍被认为是ELISA阳性，用“+”表示，阴性样本用“-”表示。参照Sambrook方法[9]，分别对‘京早晶与‘藤稔进行Western blot检测GLRaV-2、GVB和GVA（Sadarelli博士馈赠特异病毒抗血清）。

1.3 总RNA提取与RT-PCR检测

根据核酸数据库（NCBI）已知GLRaV-2基因组核酸序列（NC007448，DQ286725和AY881628），GVB基因组核酸序列（NC003602）和GVA基因组核酸序列（DQ855084，DQ855082和DQ855088），利用软件（DNAMAN 5.2.2）分别设计用于3种病毒部分基因组区域扩增的上、下游简并引物

取大约200 mg的‘京早晶（1号）与‘藤稔（2号）的1 a生成熟枝条韧皮部，分别采用3种方法提取总RNA，即热酚法[10]、LiCl法[11]，改进的硅胶颗粒吸收法[12]。其中“硅胶颗粒吸收法”，在加入硅胶前的步骤与文献[12]相同。改进部分为： 室温硅胶颗粒吸附总核酸60 min，不间断振荡5次。7 000 r·min-1室温离心 1 min，洗涤缓冲液洗涤沉淀后溶于50 μL的DEPC处理水中。DNA酶处理总核酸后，Tris饱和酚与等体积的氯仿/异戊醇抽提得总RNA。13 000 r·min-1 4 ℃离心10 min，取上清加入等体积的异丙醇。室温静置10 min，13 000 r·min-1 4 ℃离心10 min。75%乙醇洗涤沉淀后，溶解于50 μL的DEPC处理水中。取500 ng葡萄总RNA和500 ng的6碱基随机引物，使用MMLV逆转录酶（TaKaRa， 大连）合成cDNA第1条链。参照文献[13]扩增体系： cDNA 2 μL，Buffer 5×2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）1.0 μL，上下游引物各（10 μmol·L-1）0.5 μL，Tag酶0.5 μL，ddH2O 16.5 μL。分别对3种方法获得1号与2号样本的葡萄18s RNA和3种病毒目标基因组区域进行PCR扩增： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 S，61 ℃复性45 S，72 ℃延伸1 min，共计35个循环；最后72 ℃延伸7 min。在1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察电泳结果并照相记录。

1.4 3种葡萄病毒部分基因组区域克隆

分别取‘藤稔葡萄的GLRaV-2，GVB和GVA的RT-PCR扩增产物4.5 μL，线性化载体pMD19-T（TaKaRa， 大连）0.5μL，T4 DNA Ligase Mix 1.5μL（TaKaRa， 大连），14 ℃过夜连接。转化大肠杆菌感受态细菌（TIANGEN，北京），提取阳性克隆质粒并测序。同样对‘无核王子（2株）、‘希姆劳特（1株）、“南抗一号”（1株）的GVA的RT-PCR扩增产物进行克隆和测序[14]。

1.5 3种病毒的四川分离株的系统进化分析

GenBank中获得15个不同地理来源的GLRa V-2分离株CP（Coat protein， CP）全长序列（NCBI登录号： EF012720、 NC004724、 EF012718、 EF012721、EF012717、 AY697863、 AY881628、 DQ314588、DQ314603、 AY842932、 DQ314591、 AF039204、DQ314604、Y14131、AY697863），6个不同地理来源的GVB分离株CP全长序列（NCBI登录号： NC003602、 AY340582、 AY340583、 AF438410、 AB039842、EF583906）， 和来至于3个系统进化组的GVA代表分离株[5]的基因组全长序列 [（Ⅰ组： GTG11-1（DQ855084） 和IS151（NC003604）；Ⅱ组： P163-M5（DQ855082）和GTR1SD-1（DQ855081）；Ⅲ组： GTR1-1（DQ787959 ）和P163-1（DQ855088）]。

DNAStar软件进行多重比对（ClustalW方法），分析不同分离株间的核酸序列相似性。Mega 3.1（Center for Evolutionary Functional Genomics， 美国）软件采用邻接法（设定1000重复值的bootstrap评估遗传距离分枝的可信度）构建不同地理起源分离株的系统进化树。

2 结果与分析

2.1 DAS-ELISA检测与Western blot杂交

DAS-ELISA分别检测‘京早晶（1号样本）与‘藤稔（2号样本）。2号样本的DAS-ELISA检测结果为GLRaV-2，GVB和GVA阳性，而1号样本的3种病毒病检测结果都是阴性（图1）。同时，Western Blot得到与之一致的检测结果。2号样本分别有大约24 kDa、22 kDa与22 kDa的3种病毒免疫反应条带（杂交条带分子质量分别与病毒外壳蛋白核酸序列的预测分子质量相似），而1号样本没有相应大小的杂交条带（图1）。因此2号样本被GLRaV-2，GVB和GVA 3种病毒复合感染，将用于3种四川葡萄病毒的快速RT-PCR检测与系统进化研究。而1号样本是健康对照植株，没有被3种待测病毒感染。同时，‘无核王子、‘希姆劳特、‘南抗一号经过DAS-ELISA检测都是GVA阳性，将用于GVA四川分离株的系统进化分析。

2.2 比较3种葡萄总RNA提取方法

3种方法都可以从成熟枝条韧皮部组织中提取总RNA，包含葡萄的28S和18S rRNA条带但是方法1与方法2提取的总RNA为模板，RT-PCR不能扩增出大约670 bp的葡萄18s RNA目标条带。只有方法3（改进“硅胶颗粒吸收法”提取总RNA）提取的总RNA为模板，成功扩增出大约670 bp目的条带（图2）。以方法3获得‘藤稔（2号样本）的总RNA为反转录模板，RT-PCR分别扩增获得GLRaV-2约600 bp 、GVB 的600 bp 和GVA的900 bp目标产物1号样本无相应产物（数据略）。

2.3 GLRaV-2系统进化分析

克隆‘藤稔GLRaV-2四川分离株的外壳蛋白基因全长序列（597 bp），命名为“SL10分离株”（NCBI 登录号DQ91147）。16个不同地理起源的GLRaV-2分离株的CP聚类结果，包括5个系统进化组（图3）。所有组间GLRaV-2分离物核酸序列只有72.9%～77.2%同源性，而各组内分离物之间高达86.4%～100%的同源性（数据略）。四川分离物（DQ911174）和湖北分离物（AY842932）都位于I组内。II组（AY697863）和III组（EF012718）只包含一个分离株。IV组包含2个分离株（EF012720与NC004724）。V组包含2个分离株（EF012717与EF012721）。

2.4 GVB系统进化分析

克隆‘藤稔GVB分离株的外壳蛋白基因全长序列（594 bp），命名为“SL10分离株”（NCBI登录号DQ911146）。7个不同地理起源的GVB分离株CP同源性为79.1%～98.7%，（数据略）。四川与日本分离株（AB039842）的核酸同源性高达96.8%，并聚在一个进化支内

2.5 GVA系统进化分析

分别对1株‘藤稔、2株‘无核王子、1株‘希姆劳特和1株‘南抗一号的GVA扩增产物进行了克隆和测序，扩增产物全长均为839 bp。除去上下游引物（40 bp）和3末端非翻译区（43 bp）外，包括部分外壳蛋白基因（483 bp）和全长RNA沉默抑制子基因（273 bp），分别命名为分离株SL10、WHWZ5和WHWZ3、PZH28及NKYH，NCBI登录号分别为HQ671645、 HQ671659、 HQ671649、 HQ671639和HQ671665。系统进化分析的结果显示，其中3个GVA分离物（HQ671649，HQ671665和HQ671639）分别聚在组I、II和III（图5）。另外2个GVA分离物（HQ671659与HQ671645）单独聚在一起，命名为组IV。这2个GVA分离物与其他3个组的代表分离物的外壳蛋白基因的核酸同源性为80.1%～87.4%；沉默抑制子同源性为85.3%～91.9%。而2个GVA分离株间外壳蛋白基因同源性为99%；沉默抑制子为100%（数据略）。

3 讨 论

“热酚提取RNA法”与“LiCl提取RNA法”都可能不能除去成熟枝条韧皮部中的多糖、多酚等杂质对后续反应的影响。这2种方法分别以欧洲葡萄叶脉组织（V. vinifera L.）和本氏烟草叶片（Nicotiana benthamiana）为材料提取总RNA，开展病毒基因的RT-PCR扩增。采用前2种方法提取的韧皮部组织总RNA为模板，不能得到内参基因的扩增条带。而采用“硅胶吸收法”成功扩增出内参基因和病毒基因组目标区域，全程耗时5 h左右。以宿主的18s RNA为内参基因可以初步鉴定总RNA质量，保证最后检测结果的准确性。本研究建立了3种葡萄病毒的RT-PCR快速检测方法，为以后开展病毒多重RT-PCR检测研究打下了基础。

本研究中，GLRaV-2四川与湖北分离株的外壳蛋白基因聚在同一个进化支内（核酸与氨基酸同源性高达99%），湖北分离株与卷叶致病株系有关[15]。四川与湖北分离株位于系统进化I组，Bertazzon等[16]认为此组内的GLRaV-2变异株在全世界广泛分布并且诱导植株产生嫁接不亲和与卷叶症状。据报道在四川一株鲜食葡萄上复合侵染了分别来自3个进化组的GVA变异株[17]，而湖北和辽宁的20余个GVA分离株都来至于一个株系（系统进化I组）[18-19]。本研究中，来自四川不同产区的4个欧美杂交鲜食葡萄品种（V. vinifera L.×V. labrusca L.）上分离得到的5个GVA分离株之间遗传差异大，分别位于4个系统进化组。这与从欧亚种酿酒葡萄（V. vinifera L.）分离的GVA意大利种群结构一致[20]。本研究对3种葡萄病毒进行了遗传变异和系统进化研究，为四川葡萄病毒病流行与防控的紧迫性提供了理论依据。

4 结 论

快速RT-PCR成功检测了3种葡萄病毒。GLRaV-2、GVB和GVA不同地理起源的分离株在核酸水平上具有变异性，其中GVA四川分离株之间具有显著的遗传差异，可能包括4种株系。

参考文献 References：

[1] LEE JUNGMIN， MARTIN R . Influence of grapevine leafroll associated viruses （GLRaV-2 and -3） on the fruit composition of Oregon Vitis vinifera L. cv. Pinot noir： Phenolics[J]. Food Chemistry，2009， 112： 889-896.

[2] GARAU R，CUGUSI M， DORE M， PROTA U. Investigations on the yield of ‘Monica and ‘Italiavines affected by legno riccio（stem pitting）[J]. Phytopathol Mediterr， 1985， 24： 64-67.

[3] MENG B， LI C， GOSZYNSKI D E. Genome sequences of two biologically distinct strains of grapevine leafroll-associated virus 2 and sequence analysis[J]. Virus Genes， 2005 ， 31： 31-41.

[4] SHI Bu-jun， HABILI N， GAFNY R. Extensive variation of sequence within Isolates of grapevine Virus B[J]. Virus Genes， 2004， 29： 279 -285.

[5] GOSZCZYNSKI D E， PREEZ J D ， BURGER J T. Molecular divergence of Grapevine virus A （GVA） variants associated with Shiraz disease in South Africa[J]. Virus Research，2008， 138： 105-110.

[6] LIU Xiao， CHEN Jian， WANG Jian- hui， LIU Jian- jun. Identification of virus diseases in some gr apevine cultivar s and evaluation of their sanitary state[J]. Journal of Fruit Science， 2006， 23（6）： 846-849.

刘晓， 陈建， 王建辉， 刘建军. 部分葡萄品种的病毒病鉴定及健康状况评价[J]. 果树学报， 2006，23（6）： 846-849.

[7] PAN Zhi-yong， ZHAI Heng， ZUO Fang-mei， SHI Qi-zhao. The investigation of the main viruses occurrences in grapevine production areas at Shangdong[J]. Plant Protection，2002， 28（6）： 40-42.

潘志勇，翟衡，左方梅，史启照，山东葡萄产区主要病毒病发生危害调查[J]. 植物保护，2002，28（6）： 40-42.

[8] LIU Yong-qing， WANG Guo-ping. Techniques for detecting grapevine virus[J]. Sino-overseas Grapevine & Wine， 2004（4）： 27-28.

刘永清，王国平，葡萄病毒种类调查与检测技术研究[J]. 中外葡萄与葡萄酒，2004（4）： 27-28.

[9] SAMBROOK J， FRITSCHE F， MANIATIS T. Molecular cloning： a laboratory manual [M]. 2nd. NY： Clod Spring Harbor Laboratory， 1989.

[10] ROYOJI N， MASAAKI N. Efficient methods for sample processing and cDNA synthesis byRT-PCR for the detection of grapevine viruses and viroids[J]. Journal of Virological Methods， 2006， 134： 244-249.

[11] JIANG Yu， WANG Jian-hui， YANG Hui， XU Mo-yun， YUAN Shu， SUN Wen， XU Wei-lin， XI De-hui， LIN Hong-hui. Identification and sequence analysis of turnip mosaic virus infection cruciferous crops in southwest of China[J]. Journal of Plant Pathology， 2010， 92： 241-244.

[12] FOISSAC X， SVANELLA-DULUCQ M J， CANDRESSE T， GENTIT P. Polyvalent detection of fruit tree tricho， capillo and foveaviruses by nested RT-PCR using degenerated and inosine containing primers （PDO RT-PCR）[J]. Acta Hort， 2000， 550（5）： 37-44.

[13] WANG Jian-hui， LIU Jian-jun， CHEN Ke-ling，LI Hong-wen， HE Jian， GUAN Bin. Studies on the transgenic strawberry mediated by agrobacterium[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2012，25： 1011-1013.

王建辉，刘建军，陈克玲，李洪雯，何建，关斌. 根瘤农杆菌介导草莓转基因研究[J]. 西南农业学报，2012，25： 1011-1013.

[14] WANG Jian-hui， LIU Xiao， XI De-hui， YUAN Shu， JIANG Yu， YANG Hui， DU Jun-bo， ZHANG Zhong-wei， CHEN Ke-ling， LIN Hong-hui. Cloning and prokaryotic expression of CP gene of grapevine virus A Sichuan isolate[J]. Acta Horticulturae Sinica，2008， 35（7）： 967-972.

王建辉， 刘晓， 席德慧，袁澍， 蒋彧， 杨辉， 杜俊波， 张中伟， 陈克玲，林宏辉. 葡萄A病毒四川分离物的外壳蛋白基因克隆与原核表达[J]. 园艺学报， 2008，35（7）： 967-972.

[15] XU Z Y， HONG N， XING B， WANG G P. Partial molecular characterization of a Chinese isolate of grapevine leafroll-associated virus 2 and production of antisera to recombinant viral proteins[J]. Journal of Plant Pathology，2006， 88（1）： 89-94.

[16] BERTAZZON N， BORGO M， VANIN S，ANGELINI E. Genetic variability and pathological properties of Grapevine Leafroll-associated Virus 2 isolates [J]. Eur J Plant Pathol， 2010， 127： 185-197.

[17] WANG Jian-hui ，LIU Jian-jun，CHEN Ke-ling，LI Hong-wen，XI De-hui，LIN Hong-hui. Optimizing multiple detection and phylogenetic studies on grapevine leafroll associated virus-3 and grapevine virus A[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2011，38（12）： 2401-2410.

王建辉， 刘建军， 陈克玲，李洪雯， 席德慧， 林宏辉. 葡萄卷叶伴随3型病毒、葡萄A病毒多重检测优化研究与其系统进化分析[J]. 园艺学报，2011，38（12）： 2401-2410.

[18] REN Fang， FAN Xu-dong， DONG Ya-feng， ZHANG Zun-ping， WANG Jiao-min. Cloning and molecular variation analysis of coat protein gene of grapevine virus A[J]. Molecular Plant Breeding，2012， 10（5）： 568-574.

任芳，范旭东，董雅凤，张尊平，王教敏. 葡萄A病毒外壳蛋白基因克隆及分子变异研究[J]. 分子植物育种，2012，10（5）： 568-574.

[19] WANG Z Q， HONG N， LIU Y， XU W X， WANG G P. Genetic variability and population structure of Grapevine virus A in China based on the analysis of the coat protein gene[J]. Canadian Journal of Plant Pathology，2011，33： 227-233.

[20] MUROLO S， ROMANZZI G， ROWHANI A， MINAFRA A， LA NOTTE P， BRANZANTI M B， SAVINO V. Genetic variability and population structure of Grapeivne virus A coat protein gene from naturally infected Italian vines[J]. European Journal Plant Pathology， 2007， 120： 137-145.