荔枝ACO1基因克隆及其与幼果落果的关系

吴建阳 李彩琴等

摘 要： 【目的】为了探明荔枝ACC氧化酶（ACO）基因与荔枝幼果脱落的关系，【方法】用RT-PCR和RACE扩增技术相结合的方法进行ACO基因的克隆；在‘黑叶荔枝花后30 d喷施100 mg·L-1萘乙酸（NAA）来进行荔枝幼果落果的处理；用荧光定量PCR技术分析ACO基因表达与荔枝幼果脱落的关系。【结果】首次从荔枝中分离得到ACO基因，并命名为Lc-ACO1。Lc-ACO1全长为1 231 bp，其中5′非编码区包含89 bp，3′非编码区包含215 bp，开放阅读框包含927 bp，编码309个氨基酸。Lc-ACO1基因含有ACO基因特有的7个保守区和9个不变氨基酸残基。100 mg·L-1萘乙酸（NAA）可以显著促进荔枝幼果的脱落，且处理后相对落果率高峰出现在第10天，而Lc-ACO1基因在离区和幼果中的表达量高峰都出现在第7天，基因表达量高峰比相对落果率高峰早出现3 d。【结论】Lc-ACO1基因可能与荔枝幼果的脱落密切相关。

关键词： 荔枝； ACC氧化酶； 基因； 克隆； 表达； 落果

中图分类号：S667.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）属于无患子科（Sapindaceae）荔枝属（Litchi）原产于我国南部，主产区主要分布在广东、广西、福建、海南、台湾等省区。中国大陆各省份中广东省种植面积最大。荔枝的落果非常严重，是限制荔枝产量的主要因子。

器官脱落是植物界普遍发生的生理现象，不论是花器中的花瓣、萼片、雄蕊、花冠，还是植物的叶片、成熟或未成熟的果实等都会发生脱落。脱落是一种由各种因素共同调节的复杂生理过程，多种激素对其都有影响，其中乙烯被认为是促进脱落的效应剂，许多实验证明内源乙烯水平与脱落正相关。植物体内乙烯生物合成的途径为：MET（甲硫氨酸）→SAM（腺苷甲硫氨酸）→ACC（l-氨基环丙烷-1-羧酸）→乙烯，其中ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）是乙烯生物合成途径中最后一个酶、也是最关键的一个限速步骤、催化ACC转化成乙烯，控制ACO基因的表达能有效地控制乙烯的生物合成[1]。橄榄中OeACO2基因的表达随着成熟橄榄脱落的发生而不断增强[2]在苹果幼果自然脱落过程中，MdACO1和MdACO2基因在脱落果的果皮中大量表达[3]；Li等[4]对苹果采前落果的研究表明MdACO1的表达模式具有品种差异，在易发生采前落果的‘Golden Delicious品种的果皮和离区中，MdACO1基因的表达都上调，而在无采前落果的‘Fuji品种中MdACO1基因表达的增强只发生在果皮中；进一步的研究还发现在乙烯利诱导苹果幼果脱落过程中也表现出MdACO1基因表达的增强[5]。在脐橙中也发现类似的结果，乙烯利处理促进CsACO基因在脐橙叶柄离区和成熟果柄离区中的表达，1-MCP处理则抑制了该基因的表达[6]。但至今未见有关荔枝中ACO基因克隆、表达及其与果实脱落相关的报道，因此本研究通过克隆荔枝ACO基因，并分析其在荔枝幼果落果过程中的表达变化，来揭示ACO基因与荔枝幼果落果之间的关系，为调控荔枝落果提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与处理

2009年3月在华南农业大学荔枝园选取长势中庸的10 a生‘黑叶荔枝2株，其中1株用来整株喷施100 mg·L-1 NAA，另一株用作对照。在花后30 d进行田间处理，处理前先在对照树和处理树上的东南西北方向各挑选15条粗度近似的结果母枝进行挂牌，每5条为一个重复单元，每个处理重复3次。挂牌后记录其果穗上的幼果数并做好标记，每次取样前都要记录其果穗上的果实数。取样时间为处理后0、3、7、10 d。取样后用冰盒迅速带回实验室，将离区和果实分开（在果柄离层部位上下0.2 cm进行离区材料的切取），用液氮速冻后存放于-80 ℃冰箱中备用。

荔枝相对落果率的计算公式如下：

相对落果率（%）=×100（1）

Mt和Mt+d分别代表t时期和t+d时期坐果的数量。

1.2 荔枝离层总RNA的提取及其质量检测

荔枝离区和幼果总RNA的提取参照吴建阳等[7]进行。提取RNA后立即进行DNA的消化，然后利用紫外分光光度计（UV2501，岛津，日本）测定总RNA样品在260 nm和280 nm处的吸光值，以评价总RNA的纯度并计算其浓度，进一步在甲醛变性琼脂糖凝胶和MOPS缓冲液中电泳检测，以确定总RNA的质量。

1.3 引物的设计与合成

按照GenBank中登录的已知ACO基因氨基酸保守序列，设计简并引物引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 cDNA克隆

把荔枝离区和幼果的总RNA混合后反转录为cDNA，采用合成的cDNA为模板与ACO基因的简并引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94 ℃，3 min，1个循环，然后进行35个循环（94 ℃、30 s；57 ℃、30 s；72 ℃、1 min），循环完毕后，72 ℃再延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳后，切下目的片段，经回收纯化后与pMD 20-T（TaKaRa，日本）载体连接，转化感受态细胞DH5α（TaKaRa，日本），涂布于含X-gal和IPTG并具氨苄青霉素（Amp）抗性的LB琼脂平板培养基上筛选阳性克隆，然后随机挑选经EcoRI/HindIII双酶切（TaKaRa，日本）确认已插入的质粒作序列分析。测序工作委托上海英骏生物技术有限公司完成，采用ABI3730（ABI，美国）序列分析仪。在获得ACO1基因片段后，根据其cDNA片段的3′和5′端附近序列分别设计特异引物进行RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）扩增，所用试剂为3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（TaKaRa，日本）和5′-Full RACE Kit（TaKaRa，日本）试剂盒，并按照说明书上的方法进行操作。

1.5 序列分析

利用ExPASy在线翻译工具（http：//cn.expasy.org/tools/dna.html）把Lc-ACO1基因的cDNA序列翻译成氨基酸序列，再通过NCBI上的BlastX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行氨基酸序列的同源性分析，利用DNAMAN 5.0 和Clustal W进行不同物种间基因的氨基酸序列比对，并结合MEGA 5 软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树。

1.6 Lc-ACO1荧光定量表达分析

取1 μg RNA为模板，以寡核苷酸Oligo（dT）为引物，反转录酶用M-MLV（Promega），反转录反应体系为25 μL，按反转录试剂盒说明书进行反转录。用SYBR Green I（Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Kit）在ABI（Applied Biosystems）7500进行实时荧光定量PCR反应，反应程序按试剂盒说明书进行。荧光定量引物在基因的非保守区内用引物设计软件Primer 5.0进行引物设计，设计好的引物通过引物软件oligo 6.0进行引物对的评价，最后将符合条件的引物对送到上海生工公司合成。拿到引物后首先进行溶解曲线的制备，如果溶解曲线只出现单一的一个峰，说明引物的特异性比较好，可以进行后续的荧光定量试验。根据Zhong等[8]的研究，本文选用Lc-gapdh基因作为内参。对反转录所得的cDNA 分别进行6倍梯度稀释，来进行相对标准曲线的制备，进而得到Lc-ACO1基因的扩增效率为92.2%，Lc-gapdh基因的扩增效率为93.8%，所以可以用2-ΔΔCT的方法进行基因表达量的分析。做表达曲线时，每个样品重复3次，反应体系为20 μL。

2 结果与分析

2.1 RNA质量的检测

提取的RNA经DNA消化后用紫外分光光度计分别测定RNA样品的OD260和OD280的值，经计算得出各样品RNA OD260/OD280比值均在1.9～2.0，表明总RNA的纯度较高。电泳后在紫外灯下观察结果并照相由图1可知28S、18S rRNA带型完整， 28S与18S的比例接近2∶1，边沿清晰锐利，表明提取的总RNA质量高，可以进行后续的实验。

2.2 Lc-ACO1基因的cDNA全长分离、序列分析与同源性比较

通过RT-PCR和RACE扩增相结合的方法，从荔枝中获得Lc-ACO1基因的cDNA全长序列。该基因cDNA序列全长为1 231 bp，其中5′非编码区包含89 bp，3′非编码区包含215 bp，开放阅读框包含927 bp，编码309个氨基酸。应用NCBI上的BlastX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 软件对Lc-ACO1基因进行序列同源性搜索，结果显示该基因与多种植物ACO 基因的氨基酸序列具有较高的同源性（表2），其中与龙眼的同源性最高的为95% 、其次与巴西橡胶的同源性为90%。应用Clustal W 程序，将Lc-ACO1基因推导的氨基酸序列与NCBI 上已登录的其他植物的ACO基因编码的氨基酸进行多序列比对结果表明，Lc-ACO1基因含有ACO基因特有的7个保守区域和9个不变的氨基酸残基。采用MEGA 5 软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ），构建荔枝与龙眼等27 种植物的ACO基因氨基酸序列的进化树（图3），该进化树显示，Lc-ACO1基因与龙眼的亲缘关系最近、其次为巴西橡胶，这一结果与同源性分析结果相一致。

2.3 NAA处理对‘黑叶荔枝幼果脱落的影响

由图4可以看出，NAA处理后的7 d内，处理与对照的相对落果率均呈现一个上升的趋势，但两者之间没有差异，从第7天开始，NAA处理的相对落果率快速上升，而对照的反而有所下降，因此在第10天时两者差异显著拉大，处理为对照的7.8倍。

2.4 NAA处理对Lc-ACO1基因在离区中表达的影响

由图5可以看出，NAA处理后的7 d内，离区Lc-ACO1基因的表达量随时间进程呈上升趋势，7 d后呈下降趋势。NAA处理与对照中Lc-ACO1表达最大的差别一是在处理后3～7 d期间，处理急速上升，对照缓慢上升，并均在第7天达到最大值，且处理为对照的1.5倍；二是在处理后7～10 d期间，处理表现为急速下降，对照表现为缓慢下降，且在第10 d时，处理中该基因的表达量稍低于对照。

2.5 NAA处理对Lc-ACO1基因在幼果中表达的影响

由图6可以看出，对照幼果中Lc-ACO1基因的表达量在0～3 d之内快速下降，尔后（3～10 d）则持续缓慢上升；而NAA处理幼果中Lc-ACO1基因的表达量在0～3 d之内稍有增加，3～7 d期间快速上升至最大值，之后又迅速下降，并在第10天降到处理中的最低值；NAA处理与对照相比，其幼果中Lc-ACO1mRNA水平在0～7 d内一直高于对照，其中第7天时比对照高约4.5倍，第10天时比对照低。

3 讨 论

3.1 荔枝ACO基因的克隆

ACO基因最早从番茄中获得[9]，在此基础上陆续在很多植物中克隆到ACO基因，如：杨树[10]、巴西橡胶[11]、欧洲水青冈木[12]、天竺葵[13]、 康乃馨[14]、甜瓜[15]，且在多种果树作物上也克隆到ACO基因，如：番木瓜[16]、柿[17]、苹果[18]、梨[19]、桃[20]，且在同属于无患子科的龙眼上也已经克隆出ACO基因[21]，但在荔枝上至今还没有相关报道。本文采用RT-PCR 和RACE 扩增技术相结合的方法从荔枝中克隆到一个长度为1 231 bp的荔枝ACO全长cDNA序列，该基因5′端非翻译区有89 bp，3′端非翻译区有215 bp，其推测氨基酸序列含有309个氨基酸。本文所克隆的Lc-ACO1基因含有ACO基因特有的7个保守区和9个不变氨基酸残基，该基因在不同物种间的同源性很高，且与同属于无患子科的龙眼同源性最高为95%，同时也与龙眼的亲缘关系最近，基于以上几点考虑我们认为该基因属于ACO基因家族成员，且在荔枝上至今为止还没有ACO基因克隆的相关报道，所以，本文首次在荔枝上克隆出ACO基因。ACO基因均为多基因家族[22]，且不同种植物中家族成员的数目不同[23]。苹果（Malus×domestica）中ACO由4个基因编码[3]，番茄（Lycopersicon esculentum）中至少包括5个家族成员[24]，黄金梨（Pyrus pyrifolia）中至少由2个基因编码[25]，拟南芥（Arabidopsis thaliana）中至少包括6个家族成员[26]，水稻（Oryza sativa）中至少由3个基因编码[27]，甜瓜中也分离到3个ACO基因[28]，但本研究只克隆到一个ACO基因，推测这可能是该基因的器官表达特异、时空表达差异、转录水平和翻译水平差异等原因造成的。

3.2 Lc-ACO1基因与荔枝幼果脱落的关系

乙烯在植物器官脱落过程中起着重要的作用，被认为是植物脱落的天然调节剂，乙烯对果实脱落的促进作用已有很多报道[29-31]。植物体内乙烯生物合成的途径为：MET（甲硫氨酸）→SAM（腺苷甲硫氨酸）→ACC（l-氨基环丙烷-1-羧酸）→乙烯，ACO基因是乙烯生物合成途径中最后一个酶、也是最关键的一个限速步骤、催化ACC转化成乙烯，控制ACO基因的表达能有效地控制乙烯的生物合成[1]，进而调控植物器官的脱落。Zhu等[32]用NAA处理‘Delicious苹果的幼果后，幼果的落果率增加了，进而发现MdACO1基因在果实和离区中的表达量都明显增加了，乙烯释放量也增加了。Li等[31]的研究表明随着‘Delicious苹果的脱落，MdACO1基因在离区中的表达量增加了，乙烯的合成量也在增加。Shimon等[33]的研究表明番茄花柄脱落的过程中离区TAACO1、TAACO5等基因的表达量明显上调了。而本研究发现在用NAA处理促进荔枝幼果脱落的过程中，相对落果率的高峰出现在第10天，而Lc-ACO1基因在离区和幼果中的表达量高峰都出现在第7天，也就是基因表达量高峰相对于相对落果率高峰有提前效应，推测这可能是通过第7天该基因的大量表达从而导致乙烯含量的急剧上升，进而导致第10 天相对落果率大大增加。据此认为Lc-ACO1基因可能是调控荔枝幼果脱落中的一个关键基因。

参考文献 References：

[1] YANG S F， HOFFMAN N E. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 1984， 35： 155-189.

[2] PARRA-Lobato M C， GOMEZ-Jimenez M C. Polyamine-induced modulation of genes involved in ethylene biosynthesis and signaling pathways and nitric oxide production during olive mature fruit abscission[J]. Journal of Experimental Botany， 2011，62 （13）： 4447-4465.

[3] DAL Cin V， GALLA G， RAMINA A. MdACO expression during abscission： the use of 33P labeled primers in transcript quantitation[J]. Molecular Biotechnology， 2007，36 （1）： 9-13.

[4] LI J G， ZHU H， YUAN R. Profiling the expression of genes related to ethylene biosynthesis， ethylene perception， and cell wall degradation during fruit abscission and fruit ripening in apple[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2010，135 （5）： 391-401.

[5] KOLARIC J， PLESKO I M， TOJNKO S. Apple fruitlet ethylene evolution and MdACO1， MdACS5A， and MdACS5B expression after application of naphthaleneacetic acid， 6-benzyladenine， ethephon， or shading[J]. HortScience， 2011，46 （10）： 1381-1386.

[6] JOHN-Karuppiah K J， BURNS J K. Expression of ethylene biosynthesis and signaling genes during differential abscission responses of sweet orange leaves and mature fruit[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2010，135 （5）： 456-464.

[7] WU Jian-yang， PENG Gang， LI Cai-qin， LU Wang-jin， WANG Ze-huai， LI Jian-guo. A new rapid and effective method for RNA isolation from litchi tissues of fruitlet and abscission zone[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2011（6）： 1191-1196.

吴建阳，彭刚，李彩琴，陆旺金，王泽槐，李建国. 快速高效提取荔枝幼果和离区组织RNA的新方法[J]. 园艺学报， 2011（6）： 1191 -1196.

[8] ZHONG H Y， CHEN J W， LI C Q. Selection of reliable reference genes for expression studies by reverse transcription quantitative real-time PCR in litchi under different experimental conditions[J]. Plant Cell Reports， 2011，30： 641-653.

[9] HOLDSWORTH M J，BIRD C R，RAY J.Structure and expression of an ethylene-related mRNA from tomato[J].Nucl Acids Res，1987，15（2）： 731-739.

[10] TUSKAN G A， DIFAZIO S， JANSSON S. The genome of black cottonwood， Populus trichocarpa （Torr. & Gray）[J]. Science，2006，313 （5793）： 1596-1604 .

[11] KONGSAWADWORAKUL P and CHRESTIN H. Cloning and characterization of a cDNA encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase from Hevea bark： expression in response to various stresses[OL]. （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAP41850.1）

[12] CALVO A，LORENZO O，NICOLAS C. Characterization and expression of ACC synthase and ACC oxidase genes during the breaking of beechnuts dormancy[OL]. （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/CAD21844.1）

[13] CLARKL D G，RICHARDS C，HILIOTI Z. Effect of pollination on accumulation of ACC synthase and ACC oxidase transcripts， ethylene production and flower petal abscission in geranium （Pelargonium ×hortorum L. H. Bailey）[J]. Plant Molecular Biology，1997，34： 855-865.

[14] YANGKHAMMAN P，TANASE K，ICHIMURA K. Depression of enzyme activities and gene expression of ACC synthase and ACC oxidase in cut carnation flowers under high-temperature conditions[J]. Plant Growth Regulation，2007，53： 155-162.

[15] LASSERRE E，BOUQUIN T，HERNANDEZ J A. Structure and expression of three genes encoding ACC oxidase homologsfxom melon（Cucumis melo L.）[J]. Mol Gen Genet，1996，251（1）： 81-90.

[16] VARONA J，RODRIGUEZ E A，JIMENEZ E. Cloning and characterization of ripening-induced ACC oxidase gene from Carica papaya cv. ‘Maradol roja.（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAL78058.1）

[17] ZHENG Q L，NAKATSUKA A，TAIRA S. Enzymatic activities and gene expression of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid （ACC） synthase and ACC oxidase in persimmon fruit[J]. Postharvest Biology and Technology，2005，37： 286-290.

[18] LI Zheng-guo. Genes regulation and control in fruit ripening[J]. Progress In Biotechnology， 2000，20（3）： 30-34.

李正国.果实成熟的基因调控[J]. 生物工程进展，2000，20（3）： 30-34.

[19] YAMANE M，ABE D，YASUI S. Differential expression of ethylene biosynthetic genes in climacteric and non-climacteric Chinese pear fruit[J]. Postharvest Biology and Technology， 2007，44： 220-227.

[20] XU Pei-hua，LI Wei，YANG De-long. Cloning and sequence analysis of ACC oxidase gene from peach[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2010，25（2）： 44-50.

徐培华，李唯，杨德龙. 桃果实ACC氧化酶基因的克隆及序列分析[J]. 华北农学报，2010，25（2）： 44-50.

[21] XU Shi-juan， KUANG Jian-fei， LU Wang-jin. Isolation and expression pattern of ACS and ACO genes in longan fruit[J]. Journal of Fruit Science，2010，27（1）： 39-44.

徐士娟，邝健飞，陆旺金. 龙眼果实ACS 和ACO 基因克隆及其表达特性[J]. 果树学报，2010，27（1）： 39-44.

[22] BARRY C S，BLUME B，BOUZAYEN M. Differential expression of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase gene family of tomato[J]. Plant， 1996，9： 525-535.

[23] RUDUS I， SASIAK M， KEPCZYNSKI J. Regulation of ethylene biosynthesis at the level of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase （ACO） gene[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2012，6： 1-13.

[24] CARA B，GIOVANNONI J J. Molecular biology of ethylene during tomato fruit development and maturation[J]. Plant Science，2008， 175： 106-113.

[25] SHI H， ZHANG Y. Pear ACO genes encoding putative 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase homologs are functionally expressed during fruit ripening and involved in response to salicylic acid[J]. Molecular Biology Reports， 2012，39 （10）： 9509-9519.

[26] BABULA D， MISZTAL L H， JAKUBOWICZ M. Genes involved in biosynthesis and signalisation of ethylene in Brassica oleracea and Arabidopsis thaliana： identification and genome comparative mapping of specific gene homologues[J]. TAG Theoretical and Applied Genetic， 2006，112 （3）： 410-420.

[27] OUYANG S， ZHU W， HAMILTON J. The TIGR rice genome annotation resource： improvements and new features[J]. Nucleic Acids Research， 2007，35（1）： D883-D887.

[28] LELIEVER J M，LATCHE A，JONES B. Ethylene and fruit ripening[J]. Physiologia Plantarum， 1997，101： 727-739.

[29] ROBERTO Nunez-elisea， THOMAS L. Abscission of mango fruitlets as influenced by enhanced ethylene biosynthesis[J]. Plant Physiology， 1986， 82： 991-994.

[30] RUPERTI B， BONGHI C， TONUTTI P. Ethylene biosynthesis in peach fruitlet abscission[J]. Plant Cell and Environment， 1998，21： 731-737.

[31] LI J G， YUAN R C. NAA and ethylene regulate expression of genes related to ethylene biosynthesis， perception， and cell wall degradation during fruit abscission and ripening in ‘delicious apples[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2008，27（3）： 283-295.

[32] ZHU H， YUAN R， GREENE D W， BEERS E P. Effects of 1-methylcyclopropene and napththaleneacetic acid on fruit set and expression of genes related to ethylene biosynthesis and perception and cell wall degradation in apple[J]. American Society for Horticultural Science，2010，135（5）： 402-409.

[33] SHIMON Meir， SONIA Philosoph-Hadas， SRIVIGNESH Sundaresan. Microarray analysis of the abscission-related transcriptome in tomato flower abscission zone in response to auxin depletion[J]. Plant Physiology， 2010，154（4）： 1929-1956.