中国野生葡萄资源抗白腐病鉴定及抗性种质筛选

张颖 孙海生等

摘 要： 【目的】葡萄白腐病是引起葡萄减产的重要病害，葡萄白腐病不但在我国流行严重，在世界上主要葡萄产区都有发生，由于白腐病菌难以防治，挖掘抗病种质有利于抗病机制研究及抗病育种的开展。【方法】研究利用室内离体菌丝接种的方法，对收集到的中国野生葡萄种质17个种、亚种及种间杂种的35个株系进行葡萄抗白腐病鉴定。【结果】结果表明，中国野生葡萄不同种之间对白腐病的抗性存在差异，其中都安毛葡萄、塘尾葡萄实生、刺葡萄♂、刺葡萄♀、舞钢庙街桑叶、蘡薁武汉A1、灵宝变叶、燕山葡萄0947为抗病株系，刺葡萄♂为最抗病的株系，是研究抗白腐病机理的理想材料。【结论】在中国野生葡萄中存在葡萄白腐病的抗性植株。

关键词：中国野生葡萄； 抗病； 葡萄白腐病； 离体接种

中图分类号：S663.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0191-06

葡萄是我国栽培最广泛的水果之一，2010年，我国葡萄栽培面积为55.2万hm2，总产量达843万t，为世界第2位和第1位（来源于FAO，2010年），并且还在逐年增加，与葡萄产业的发展伴随的是葡萄病害的发生和危害，白腐病是严重危害葡萄生产的四大病害之一，对葡萄的危害包括降低树势、损毁枝蔓、降低产量甚至引起绝收，严重威胁葡萄生产，如何提高葡萄对白腐病的抗性是亟待解决的问题。葡萄白腐病又称腐烂病，致病菌为Coniothyrium diplodiella（Speq.）Sacc，属于壳小圆孢属，为葡萄专性寄生，不仅危害果粒还危害枝条和叶片，是葡萄生长期引起果实腐烂、导致减产的主要病害。

我国葡萄的主要栽培品种是欧亚种，但是欧亚种对白腐病都缺乏抗性，起源于中国葡萄属植物种类多、遗传资源丰富，已知的葡萄野生种约38个种，种类约占世界的60%，并且新种还时有发现[1]，在这些野生种中蕴含大量的抗性资源[2]，在前人的研究中刺葡萄、山葡萄和华东葡萄中都有抗病的株系[3]，但是受资源收集数量的限制，缺乏对中国野生葡萄资源的全面系统的评价。挖掘真正的抗病种质，研究中国野生资源的抗性机理对改良现有栽培品种的抗性、培育抗性新种质有重要的实践和理论意义。抗病性人工接种鉴定法可以避免田间环境条件和病原种类、数量的差异。因此，在相同条件下，采用统一的评价方法和评价指标对大量种质资进行抗病性的系统评价具有十分迫切的需求。由于利用病菌孢子接种及室外接种的鉴定方法极易受到外界环境的影响，如湿度、温度的变化会影响病原孢子的萌发率，从而影响实验结果，获得可靠的结果需要几年的连续调查。本研究借鉴前人的鉴定方法[4]，研究者采用室内离体鉴定的方法，避免外界条件的影响；同时采用菌丝体接种，避免因孢子萌发不整齐的误差，制造伤口打破叶片结构性引起的抗性反应，以期快速准确鉴定中国葡萄野生种质中的抗病株系，并为其抗病机理的研究提供材料及理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料均采自郑州果树研究所国家种质（葡萄）资源圃，编号为资源圃编号

1.2 病菌培养

葡萄白腐病病原菌来源于中国农业科学院植物保护研究所。葡萄白腐病病菌为葡萄专性寄生，可以离体培养，将病菌接种于PDA固体培养基上，28 ℃下黑暗培养，3 d后菌丝均匀分布，但未产生孢子，4 ℃保存备用。

1.3 接种及保湿方法

取枝条上中部成熟叶片（叶龄10～15 d），每个处理取6枚叶片，将菌饼和无菌PDA块（CK）分别接种叶片的正面，刺伤时避开叶片主脉，每个叶片接种1～4处，分布于叶片的不同位置，同时设6个重复，将接种后的叶片放入大培养皿的下底内，上盖覆浸湿但不滴水的滤纸，不能接触叶片，封口膜密封保湿，28 ℃黑暗培养。

1.4 伤口处理方法

以‘康可和‘红地球为试材，采用无伤、接种1针刺伤、5针刺伤（均匀分布在菌饼下直径2 mm的圆形区域内，下同）等3种伤口处理方式，试验重复3次，连续观察。

1.5 叶片正反面接种处理

以‘康可和‘红地球为试材，分别设正、反面接种处理，利用1.2和1.3中的方法进行处理。

1.6 处理时间

以‘康可和‘红地球为试材，接种后利用1.2和1.3中的方法进行处理，并在接种60 h后统计。该试验重复2次，连续2 a统计结果。

1.7 种质鉴定

综合分析1.2、1.3、1.4处理的结果，选择最佳处理条件，对已经收集到的中国野生葡萄资源的不同种及株系，进行白腐病抗性鉴定及抗性种质筛选。以美洲种的‘康可和欧亚种的‘红地球为参照。

1.8 结果统计及分析方法

采用十字交叉法测量病斑直径，处理间的差异显著性分析用Duncans Multiple Range Test进行，以常见的‘红地球和‘康可为分级参照，抗性分级如下：Ⅰ>‘康可；‘康可<Ⅱ>‘红地球；Ⅲ<‘红地球，筛选抗性种质。

2 结果与分析

2.1 葡萄种质资源鉴定刺伤条件

为了确定叶片发病程度与伤口之间关系，以‘康可和‘红地球为试材，采用未针刺、1针刺和5针刺3种处理方式，48、60、72、84 h连续统计病斑大小，采用十字交叉法测量病斑直径，处理间的差异显著性分析用Duncans Multiple Range Test进行。结果显示，在以‘康可为试材的试验中，病斑大小在有伤口与没有伤口的处理中差异显著，但是在伤口大小的处理中差异不显著；在以‘红地球为试材的试验中，病斑大小在伤口有无与伤口大小差异均不显著。基于以上结果以下试验均采用1针刺的处理方法。

2.2 葡萄种质资源鉴定的接种位置

以‘康可和‘红地球为试材，采用1针刺的处理方法，分别在叶片正面和背面接种，接种60 h后，统计病斑，分析差异。结果表明，‘康可和‘红地球叶片正面和背面接种后，病斑大小差异不显著基于操作方便的考虑，在鉴定种质抗性的试验中采用叶片正面接菌。

2.3 葡萄种质资源鉴定

在室内环境条件一致的情况下，以美洲种的‘康可和欧亚种的‘红地球为对照种质，对中国野生种的17个种的35个株系进行了白腐病的抗性鉴定，结果显示其抗病性由大到小分别为：刺葡萄♂、舞钢庙街葡萄桑叶、燕山葡萄、刺葡萄♀、武汉A1、塘尾实生、都安毛葡萄、灵宝变叶、‘康可、菱叶葡萄0945、华东1057、红岩华东01、青要山秋葡萄、美丽葡萄1104、湖南云南葡萄、宝天曼网脉葡萄、葛蕌♀、葛蕌♂、湖南刺葡萄、嵩山桦叶、云南葡萄、桦叶、广西毛葡萄、四道岭变叶、灵宝秋葡萄、双溪腺枝01、双溪腺枝03、‘红地球、桑叶943、高山2号、华佳八号、多裂叶蘡薁、桑叶1099、桑叶946、华东1058、九里沟桑叶、青要山蘡薁（图5）。

为了使鉴定结果有一个比较直观的表现，以‘康可和‘红地球参照种质进行抗性分级，共分为三级，Ⅰ级抗性高于‘康可，Ⅱ级抗性处于‘康可和‘红地球之间，Ⅲ级抗性低于‘红地球。Ⅰ级抗性有：都安毛葡萄、塘尾葡萄实生、刺葡萄♂、刺葡萄♀、舞钢庙街桑叶、蘡薁武汉A1、灵宝变叶、燕山葡萄0947；Ⅱ级抗性的有：菱叶葡萄0945、华东1057、红岩华东01、青要山秋葡萄、美丽葡萄1104、湖南云南葡萄、宝天曼网脉葡萄、葛蕌♀、葛蕌♂、湖南刺葡萄、嵩山桦叶、云南葡萄、桦叶、广西毛葡萄、四道岭变叶、灵宝秋葡萄、双溪腺枝01、双溪腺枝03；Ⅲ级抗性的有：桑叶943、高山2号、华佳八号、多裂叶蘡薁、桑叶1099、桑叶946、华东1058、九里沟桑叶、青要山蘡薁（表2）。结果表明，中国野生葡萄不同种之间对白腐病的抗性存在差异，刺葡萄最为抗病，腺枝葡萄最不抗病；毛葡萄、桑叶葡萄、蘡薁葡萄、变叶葡萄中存在抗病株系，其中刺葡萄♂最为抗病。

3 讨 论

在田间自然条件下，来源于欧亚种的葡萄种质都不同程度地感染白腐病，而中国野生种质未见感病[5-7]，本试验中人工针刺接种时，野生种质会有不同程度的感病，有的野生种甚至超过了欧亚种，如多裂叶蘡薁、桑叶1099、桑叶葡萄946、华东葡萄1058、九里沟桑叶、青要山蘡薁等。分析存在差异主要有两方面的因素，其一，本试验中采用的是菌丝接种的方法，菌丝可以直接侵染，排除了葡萄白腐病病菌孢子不萌发造成的误差；其二本试验中接菌时制造了伤口，破坏了叶片的表面结构，排除了葡萄叶片因表面结构造成的抗性，因此抗性反应来源于植物内在机制的作用，是植物本身通过内在免疫反应的表现。

王跃进等[5]研究结果表明刺葡萄的果实表皮细胞层和角质层比欧洲葡萄品种佳利酿厚的多，而且表皮细胞排列也紧密，有利于保护野生种葡萄免受白腐病病菌侵染。姜建福等[8]对中国野生葡萄叶片显微和超微结构观察发现，中国野生葡萄中毛葡萄、桑叶葡萄的叶片总厚度和叶片各组织厚度较小，桦叶葡萄在东亚种群中叶片总厚度和叶片各组织厚度最大，本研究中的抗性结果与其并无一定的相关性，并且从叶片结构的角度难以解释种内不同株系的抗性差异。以菌丝为病原菌的侵染方式不同于自然界中病原菌的侵染方式，但是更能表现不同种质内在的免疫反应。

在生理生化水平上，中国野生抗性种质中的确存在内在的抗性机理，王跃进等[5]在研究中认为生物体内生化物质对病原菌有能动反应，他推测是植物体内的丹宁，游离有机酸和多酚氧化酶的高含量或高活性对病菌的扩展起到了抑制作用。贺普超等[2]研究葡萄叶片和果实对白腐病的抗性与可溶性糖、游离有机酸和过氧化物酶活性有密切关系。

分子生物学研究表明，植物在受到病原菌入侵时，体内转录组会发生很大的变化，转录因子被激活，进而调控下游抗性基因的表达，从而达到抗病目的。重要的转录因子包括WRKY、MYB、ERF、NAC 等转录因子家族。作为葡萄白腐病抗性极强的种质，进一步从生理生化和分子生物学水平研究刺葡萄♂的抗性机理将为葡萄的抗性育种提供理论及实践方面的依据。

4 结 论

中国野生葡萄不同种之间对白腐病的抗性存在差异，其中都安毛葡萄、塘尾葡萄实生、刺葡萄♂、刺葡萄♀、舞钢庙街桑叶、蘡薁武汉A1、灵宝变叶、燕山葡萄0947为抗病株系，刺葡萄♂为最抗病的株系，是研究抗白腐病机理的理想材料。

参考文献 References：

[1] KONG Qing-shan. Chinese Ampelography[M]. Beijing：China Agricultural Science and Technology Press， 2004： 16-25.

孔庆山. 中国葡萄志[M]. 北京： 中国农业科学技术出版社， 2004： 16-25.

[2] HE Pu-chao， WANG Yue-jin， WANG Guo-ying，REN Zhi-bang，HE Chun-cheng. Research Chinese wild vitis disease resistance[J]. Scientia Agricultura Sinica， 1991，24（3）： 50-56.

贺普超，王跃进，王国英，任治邦，和纯成. 中国葡萄属野生种抗病性的研究[J]. 中国农业科学， 1991， 24（3）： 50-56.

[3] WANG Yue-jin， HE Pu-chao. Identification method of resistance of vitis evaluated to grape anthracnose and grape white rot[J]. Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry， 1988， 16（8）： 17-21.

王跃进，贺普超. 葡萄白腐病和黑痘病抗性鉴定方法[J]. 西北农业大学学报， 1988，16（8）： 17-21.

[4] WEI Jie-ling， HUANG Li-li， HAO Zuo-peng， KE Xi-wang， KANG Zhen-sheng. Laboratory evaluation methods of apple Valsa canker disease caused by Valsa ceratosperm a sensu Kobayashi[J]. Acta Phytopa Thologicas in Ica ， 2010，40（1）： 14-20.

韦洁玲，黄丽丽，郜佐鹏，柯希望，康振生. 苹果树腐烂病室内快速评价方法的研究[J]. 植物病理学报， 2010，40（1）： 14-20.

[5] WANG Yue-jin， HE Pu-chao. Study of white rot disease resistant mechanism in Chinese Vitis wild species[J]. Northern Horticulture， 1988（1）： 1-5.

王跃进，贺普超. 中国葡萄属野生种抗白腐病机制研究[J]. 北方园艺， 1988（1）： 1-5.

[6] LI Dan， WAN Yi-zhen， WANG Yue-jin， HE Pu-chao. Relatedness of resistance to anthracnose and to white rot in Chinese wild grapes[J]. Vitis， 2008，47（4）： 213-215.

[7] LI Feng， FAN Xiu-cai， LIU Chong-huai， ZHANG Ying， JIANG Jian-fu， LI Min. Investigation resistance to white rot in grape germplasm resources[J]. China Fruits，2012（3）： 72-74.

李峰，樊秀彩，刘崇怀，张颖，姜建福，李民. 葡萄种质资源对葡萄白腐病抗性调查[J]. 中国果树， 2012（3）： 72-74.

[8] JIANG Jian-fu， ZHANG Ying， TIAN Zhi-shuo， FAN Xiu-cai， LIU Chong-huai. Observation on microstructure and ultrastructure of leaves in Vitis L.[J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 2012，32（7）： 1365 -1371.

姜建福，张颖，田智硕，樊秀彩，刘崇怀. 葡萄属植物叶片显微和超微结构观察[J]. 西北植物学报， 2012， 32（7）： 1365-1371.