落葵果实多糖的提取及含量的测定

赵建芬，李妍，董基，黄清华

（肇庆学院化学化工学院，广东肇庆526061）

落葵（Basella rubra L.）又称木耳菜、胭脂菜、紫藤菜、篱笆菜等，原产于亚洲南部地区，是一类生长迅速、适应性广、容易栽培的药菜兼用植物，我国各地均可种植[1]。落葵除含丰富的营养成分外，还含有皂甙、葡聚糖、黏多糖等药用成分[2]。落葵全株可入药，种子和叶片入中药味甘。成熟落葵果实为紫红色，含有甜菜花青素[3]和糖类物质。目前国内外的研究报道中鲜有从落葵果实中分离多糖的报道。多糖（Polysaccharide）是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖，是构成生命体的四大基本物质之一。当前的研究表明活性多糖与增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和降血脂等密切相关[3]。因此，对落葵果实多糖的提取将为其药理活性的研究打下基础，并有助于多糖资源的开发和利用。本工作采用超声法、索氏法和水提法3种方法提取落葵果实多糖，苯酚-硫酸比色法测定其含量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

新鲜红花落葵果实：采自高要市莲塘农家菜园。

1.1.2 仪器、试剂

S22/S22PC可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；RE-5299旋转蒸发器：河南巩义市宇翔仪器有限公司；超声波清洗器SB25-12D：宁波新芝生物科技有限股份公司；索氏提取器：购自肇庆顺达有限公司；BS210S电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。铝片、无水碳酸钠、活性炭，葡萄糖对照品、浓硫酸、石油醚、95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇等均为分析纯，苯酚为化学纯，药品均购自天津市广成化学试剂有限公司。

1.1.3 溶液的配置

1.1.3.1 5%苯酚试剂的制备

称取苯酚50 g于100 mL烧瓶中，加入0.05 g铝片和0.025 g碳酸氢钠，蒸馏。收取182℃馏分。然后称取纯苯酚固体7.5 g，加水溶解并定容至150 mL，置棕色瓶内放冰箱备用。

1.1.3.2 葡萄糖标准溶液的配置

称取105℃干燥恒重的葡萄糖0.025 0 g，加水溶解并定容至250 mL，配成浓度为100.0 μg/mL葡萄糖标准溶液，放冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

精密量取葡萄糖标准溶液 0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL置干燥试管中，分别加水至1.00 mL，加入5%苯酚溶液1.50 mL，浓硫酸7.50 mL，摇匀。室温放置25 min，以不加葡萄糖标液的试剂空白为参比，在490 nm[4]处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，葡萄糖浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程。

1.2.2 落葵果实多糖精制品的制备[4－5]

将新鲜的落葵果实清洗干净，于烘箱中60℃恒温干燥2 d，然后粉碎成粉末，密封备用。

称取落葵果实粉末50 g，用250 mL石油醚于60℃～80℃的水浴中回流脱脂2次，每次1 h。再用250 mL 80%乙醇于80℃～90℃的水浴中回流提取2次，每次2 h，除去单糖、双糖、低聚糖、皂苷类和多酚类等物质。残渣加水250 mL，90℃水浴中提取2次，每次2 h。合并两次水提取液，50℃减压浓缩至75 mL，加2 g～3 g活性炭进行脱色。经两次脱色后，滤液加5倍量95%乙醇，放置过夜，抽滤。抽滤后的沉淀加适量水溶解，采用Sevag法[6]脱去蛋白质，即按溶液1/5体积加入氯仿－正丁醇（预先配制成体积比为4∶1混合液），剧烈振摇20 min，静置分层，弃去水层与有机层交界处的变性蛋白，重复一次。取水相，50℃减压浓缩至适当体积，加5倍量95%乙醇沉淀，沉淀再分别以95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，60℃干燥，即得纯度较高的白色落葵果实多糖。

1.2.3 落葵果实多糖换算因素的测定[4－5]

精确称取60℃干燥恒重的多糖精制品0.035 0 g，水溶解后定容至100 mL，为多糖精制品储备液。精确量取多糖精制品储备液0.20 mL加水至1.00 mL，按测定标准葡萄糖溶液的方法测其吸光度，代人回归方程，算出多糖溶液中葡萄糖的浓度C，从而计算换算因素：

式中：W为多糖质量，μg；C为多糖溶液中葡萄糖的浓度，（μg/mL）；D为多糖的稀释体积mL。

1.2.4 超声法、索氏法和水提法提取落葵果实多糖及其含量的测定

称取落葵果实粉末9份，每份约0.2 g，按下列步骤进行多糖的提取：①取3份样品，分别加入100 mL 80%乙醇，于45 kHz超声提取40 min，倾去上清液，再加100 mL 80%乙醇重复提取一次，以除去单糖、双糖和低聚糖。然后减压抽滤。残渣挥去乙醇溶剂后，加100 mL水，于45 kHz超声提取40 min，再加水重复超声提取一次。合并两次水提取液，反复洗至250 mL容量瓶中，定容，作为超声提取法的样品液。②取3份样品，分别用20 mL 80%乙醇浸泡过夜。再于索氏提取器中用80 mL 80%乙醇回流2 h，残渣挥去乙醇溶剂后继续用水回流提取2 h。用水反复洗至250 mL容量瓶中，定容，成为索氏提取法的样品液。③取3份样品，分别用100 mL石油醚70℃水浴提取2次，每次1 h，以除去油脂。去除石油醚溶剂后，分别用100 mL 80%的乙醇于80℃的水浴中提取2次，每次1 h，以除去单糖和低聚糖。再将残渣用100 mL水于90℃的水浴中提取2次，每次1 h。合并两次水提取液并定容为250 mL，成为水提取法的样品液。

分别精确吸取样品液1.00 mL，按测定标葡萄糖溶液的方法测其吸光度，根据回归方程计算浓度C，按下式分别计算多糖含量：

式中：C为样品溶液的葡萄糖浓度，（μg/mL）；D为样品溶液的稀释体积，mL；f为落葵果实多糖换算因素；W为样品的质量，μg。

1.2.5 超声法提取多糖重现性和回收率的测定

精密吸取同一超声样品提取液0.50 mL（5份），分别精密加入多糖精制品储备液0.50 mL，按测定标准葡萄糖溶液方法测其吸光度，检验方法的重现性。

精密吸取同一超声样品提取液0.50 mL（5份），分别精密加入葡萄糖标准溶液 0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，按测定标准葡萄糖溶液方法测其吸光度，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

根据葡萄糖标准溶液的溶度和测得的吸光值，绘制葡萄糖标准曲线，如图1所示。回归方程为A=0.065 2 C+0.000 2，R2=0.999 1，表明在 1.00 μg/mL ～7.00 μg/mL浓度范围内，葡萄糖标准曲线线性关系良好，可用于样品液的测定。

2.2 落葵果实多糖换算因素的测定

测得多糖精制品溶液的吸光度A=0.277，代人回归方程，算得显色反应液中葡萄糖浓度为4.258 μg/mL，则多糖液中葡萄糖的浓度C=4.258×10.0/0.20=212.9 μg/mL，计算换算因素：f=W/CD。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose solution

式中：W为多糖质量，μg；C为多糖液中葡萄糖的浓度，（μg/mL）；D 为多糖的稀释体积，mL。

2.3 超声法、索氏法和水提法提取落葵果实多糖及其含量的测定

对超声法、索氏法和水提法提取的落葵果实多糖含量进行测定，计算结果如表1所示。

表1 3种方法提取落葵果实多糖的含量Table 1 Content of polysaccharide from the fruits of Basella extracted by three different methods

从表1可知，在考察的3种方法中，超声法提取的多糖含量是索氏法的1.62倍，是水提法的2.65倍。而且超声法提取时间短，无需加热，大大提高了多糖的提取效率。由此，超声提取多糖的方法优于其他两种方法。

2.4 超声法提取多糖重现性和回收率的测定

超声法提取落葵果实多糖重现性测定结果如表2所示，回收率测定结果如表3所示。

表2 重现性实验结果（n=5）Table 2 Result of reproducible test（n=5）

如表2所示，RSD=1.24%，说明方法重现性良好，精密度高。

表3 回收率实验结果Table 3 Result of recovery experiment

微量组分的回收率在95%～110%，认为方法可靠[7]。从表3可知，落葵果实多糖平均回收率高，在微量组分回收率要求的范围内，且RSD值较小，由此可见，所建立的苯酚-硫酸比色法的准确度高、可靠性好。

3 结论

1）建立苯酚-硫酸比色法测定多糖的含量，回归方程为 A=0.065 2C+0.000 2，R2=0.999 1，在 1.00 μg/mL～7.00 μg/mL浓度范围内，葡萄糖标准曲线线性关系良好，而且方法可靠、重现性好，测定结果稳定、准确度高，适用于落葵果实多糖的测定。

2）采用精制落葵果实多糖测得落葵果实多糖对葡萄糖的换算因子f=1.644。

3）不同的提取方法对落葵果实多糖的提取率不同，超声法为6.240%，索氏法为3.854%，水提法为2.357%。三种方法中超声法提取率最高，提取时间最短，无需加热，所以超声法提取落葵果实多糖的效率高于其他两种方法。

[1] 陈连文,刘敬兰,师建华.落葵色素的提取及其稳定性的研究[J].化学世界,1995,49(11):581-583

[2] 卢毓星,岳森,卢隆杰.营养保健型蔬菜—落葵[J].特种经济动植物,2006,9(2):30-31

[3] 彭会军.落葵多糖的提取分离与药理学研究[D].武汉：华中农业大学生命科学技术学院,2008:8-13

[4] 王自军,邓红.白芥子多糖的超声提取及含量测定[J].数理医药学杂志,2004,17(2):175-176

[5] 王文平,郭祀远,李琳,等.苯酚-硫酸法测定野木瓜中多糖含量的研究[J].食品科学,2007,28(4):276-278

[6] 齐慧玲,魏绍云,王继伦,等.Sevag法去除白及多糖中蛋白的研究[J].天津化工,2000,13(3):20-21

[7] 华东理工大学,四川大学.分析化学[M].6版.北京：高等教育出版社,2009:12