辛辣组分对高良姜提取物抗菌活性的影响

（广东医学院广东省天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江 524023）

高良姜（Alpinia officinarumHance）为十大广药之一，具有温中散寒，理气止痛等功效。近年来报道高良姜提取物具有抑菌、抗癌、抗氧化和清除自由基等多种重要药理活性[1]，其黄酮类药用资源堪比银杏叶，所富含的高良姜素被认为是蜂胶的主要活性成分[2-4]。但高良姜十分辛辣，在医药、保健食品等方面的应用和剂型选择上受到限制。本文分离提取出高良姜中的辛辣组分，对分离前后各部分的抗菌作用进行评价和比较，探讨辛辣组分的分离对高良姜抗菌活性的影响，为高良姜活性成分保健食品的组方和调味品特色开发提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

LC-10Avp型高效液相色谱仪：日本，岛津；旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；超声清洗仪：上海必能信超声有限公司；砂芯漏斗（250 mL，直径70 mm）。DL-CJ-2F实验医用超净工作台：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司北京分公司；隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；自动台式灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司。

1.1.2 原料与试剂

高良姜：人工种植3年，采于广东徐闻龙塘镇八角村；乙腈、甲醇、四氢呋喃（HPLC级）：美国TEDIA试剂公司；其它试剂均为分析纯；二苯基庚烷A对照品（Diaryl-heptanoid A，DHA）：广东医学院广东省天然药物研究与开发重点实验室纯化；注射用双黄连冻干粉针剂：哈药集团中药二厂，批号0611008；硅胶G高效薄层板、HF254薄层层析硅胶（200目～300目）：青岛海洋化工产品。

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌均由广东医学院病原生物学实验室提供。采用MH培养基培养金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌（培养24 h），采用沙保培养基培养白色念珠菌（培养48 h）。

1.2 方法

1.2.1 高良姜提取物的制备

取高良姜根茎的干燥粉末（40目），以乙酸乙酯超声提取3次（室温，30 min/次），提取液减压浓缩，制备成浸膏，得总提取物；浸膏以 72%乙醇∶石油醚（1∶1，体积比）萃取，分取含水乙醇层和石油醚层；含水乙醇层减压浓缩制得提取物Ⅰ。采用减压硅胶柱层析（VLC）对提取物Ⅰ作进一步分离。

1.2.2 减压硅胶层析柱的制备[5]

250 mL砂芯漏斗中装入薄层层析硅胶（200目～300目），在真空泵减压条件下装柱，形成直径10 cm、高5.5 cm的柱床。在减压条件下以石油醚活化硅胶柱，并以流动相前沿平行度检测装柱质量。抽干石油醚后即可上样。

1.2.3 辣味成分的分离

称取10 g提取物Ⅰ，用丙酮为溶剂分散于薄层层析硅胶中，干法上样。选用石油醚-乙酸乙酯体系为洗脱剂，洗脱剂中乙酸乙酯的含量（V/V）依序为30%、33.3%、35%、36%、36.3%、36.6%、38%、39%、40%、41%、42%、100%，每个配比的洗脱剂洗脱1倍柱床体积、并抽干，共得12个馏分。分别收集洗脱液并浓缩，以薄层色谱（Thin-layer chromatogram，TLC）检测分离效果，并对各组分的辣味进行感官检测。合并36.6%～39.0%馏分为辛辣组分，其余部分合并为非辛辣组分。非辛辣组分标记为提取物Ⅱ，辛辣组分标记为提取物Ⅲ。

1.2.4 纸片琼脂扩散法抑菌试验[6]

以双黄连注射液为阳性对照，采用抑菌圈法测定提取物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的抗菌活性。菌株选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌白色念珠菌、大肠杆菌4种，提取物药液设3浓度水平3平行，同时作丙酮和蒸馏水作空白对照。用无菌棉拭沾取菌液在MH琼脂平板（白色念珠菌用沙保琼脂平板）表面作均匀密集划线，3 min～5 min后用无菌镊子将含有药液的滤纸片紧贴于涂菌琼脂表面上。将平板置于37℃生化培养箱中，分别培养24 h和48 h。以上步骤均在无菌条件下操作。测定各样品的抑菌圈直径，计算平行样的平均值。药液浓度和抑菌圈测定结果如表1。

1.2.5 试管二倍稀释法测定MIC

根据抑菌实验的结果，选取敏感菌测定各药液的最低抑菌浓度。

1）供试液配制：以95%乙醇将提取物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别配制成100、72、28 mg/mL3个浓度的供试液；双黄连粉针剂用蒸馏水配制为8 g/mL的供试液。

2）药物浓度倍比稀释取110支试管排成10排，每排11支试管，每种药物2排（2个平行）。另取2支试管用作“肉汤”和“待测菌生长”对照。每排第1支试管中加入5.7 mL的MH肉汤，每排第2支试管为空管，其余各管内加入2 mL的MH肉汤。在每排第1支试管分别中加入0.3 mL药液，混匀后从中吸取2 mL分别加入第2、3支试管中，混匀后从第3支试管中吸取2 mL加入第4支试管，依次对倍稀释至11管；同时乙醇阴性对照。

表1 高良姜提取物对4种菌株的抑菌圈直径Table 1 Diameter of antibacterial circle of extracts from Galangal for 4 bacteria mm

3）待测菌悬液的制备：挑取孵育18 h～24 h的平板上数个菌落于3 mL～5 mL生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏比浊标准（约108 cfu/mL）。

4）每排第1支试管及肉汤对照除外，其余各管分别加入40μL菌悬液，使最终细菌接种量为106 cfu/mL。放在37℃恒温箱培养24 h（白色念珠菌48 h）后观察，以无肉眼可见菌生长的最低药物浓度为该药的最低抑菌浓度（MIC），结果见表2。

表2 高良姜提取物对3种菌株的MICTable 2 MIC of extracts from Galangal for 3 bacteria

1.2.6 MBC的测定

MIC测定后，将未见菌生长各管培养物混匀后，吸取0.1 mL于MH琼脂平板（白色念珠菌用沙保琼脂平板）上，涂布均匀，每个样品平行2份，置37℃恒温箱培养24 h（白色念珠菌48 h）后观察结果，以菌落平均数少于5个的最低药物浓度为该药的最低杀菌浓度（MBC），结果见表 3。

表3 高良姜提取物对3种菌株的MBCTable 3 MBC of extracts from Galangal for 3 bacteria

2 结果与讨论

2.1 分离效果评价

2.1.1 TLC检测

以1.2.3项下得到的12个洗脱液进行薄层色谱分离检测。取样 5 μL 点板，以氯仿∶甲醇=99∶1（体积比）展开、5%香草醛-浓硫酸显色，薄层色谱图如图1。

图1 VLC分离组分的薄层色谱图Fig.1 TLC Chromatogram of fragments eluted from VLC

图中色谱轨道由左到右1～12道为VLC洗脱流份，石油醚-乙酸乙酯体系中乙酸乙酯的含量依序为30%、33.3%、35%、36%、36.3%、36.6%、38%、39%、40%、41%、42%、100%（体积分数）。第13道为提取物Ⅰ，第14道为DHA（二苯基庚烷A，辣味成分对照品）。

2.1.2 提取物的HPLC检测

将提取物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以甲醇制成每毫升相当于0.1g生药的试液，过0.45μm滤膜；同时以甲醇配制100 μg/mL二苯基庚烷A对照品溶液，进行HPLC检测。液相色谱条件：DiamonsilC18色谱柱（250mm×2.0mm，5.0 μm）；流动相A为0.1%醋酸-水、流动相B为乙腈-甲醇-四氢呋喃（15∶40∶45）；色谱程序为：0～20 min，39%B～61%B；20 min～30 min，61%～100%B；30 min～40 min，100%～100%B；0～19 min，280 nm；19 min～40 min，345 nm；流速0.2 mL/min，柱温35℃，进样体积5 μL。色谱图如图2。

图2中的a、b、c、d四张图对比表明，提取物Ⅰ中的辣味成分得到了较好的分离，提取物Ⅲ（辣味组分）主峰的保留时间与二苯基庚烷A对照品一致，提取物Ⅲ主峰的归一化面积比近90%。

图2 高良姜提取物的色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of extracts

2.2 抗菌活性评价

利用VLC从高良姜提取物中分离出的不同部位对4种菌株的抑菌圈、MIC和MBC实验结果表明，脱除辣味成分的高良姜提取物Ⅱ对革兰氏阳性菌（金葡，枯草）和真菌（白色念珠菌）均具有明显的抑制作用，且其抗菌作用强于双黄连（其MIC和MBC均小于双黄连200 mg/mL和400 mg/mL）、且呈剂量依赖性。提取物Ⅱ的抗菌作用强于提取物Ⅰ，提取物Ⅲ（辛辣组分）的抗菌作用最弱。

3 结论

减压硅胶柱层析（VLC）制备色谱每次可洗脱所选流动相下Rf值大于0.5的组分。每次洗脱后抽干，可以根据目标成分机动选择流动相的配比，也可以逐步改变流动相比例实现梯度洗脱。该方法突出了被分离组分之间分配系数上的差异，受色谱峰扩散影响小，可间歇操作，因而具有简捷、高效的特点，特别适用于天然产物目标成分的分离制备[7]。

高良姜提取物Ⅰ富含黄酮类和二苯基庚烷类等芳香类活性成分，从中分离出辣味部位（提取物Ⅲ）后的高良姜提取物Ⅱ，对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌及白色念珠菌仍有较强的抑菌和杀菌作用，活性与提取物Ⅰ基本相当、且活性呈剂量依赖性。本实验表明，对所试的4个菌株，辣味部位（提取物Ⅲ）非高良姜抗菌活性的主要成分。

[1] 吕玮,蒋伶活.高良姜的化学成分及药理作用[J] .中国药业,2006,15(3):19-21

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[5] Harwood L M.‘Dry Flash’Column Chromatography[J] .Aldrichimica Acta,1985,18(1):25

[6] 徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M] .2版.北京：人民卫生出版社,1991:1340-1350

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