软枣猕猴桃多糖的分离纯化及抗氧化活性测定*

宣丽，刘长江，刘洋

1(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳，110866)2(沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳，110866)

软枣猕猴桃Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch.ex Miq.又名软枣子、猕猴梨、藤梨，是猕猴桃科、猕猴桃属多年生落叶藤本植物［1－2］。该树种因其叶大而密，花白色并具香味，果实外表光滑呈翠绿色，植株抗病虫害、抗寒能力强［3－4］，已成为当前一种价值高、用途广、极具发展前景的野生果树。目前对软枣猕猴桃的研究主要集中在种质资源［5－7］;花、茎、叶、根中化学成分与药理活性的研究与应用［8－12］;果实的贮藏与保鲜［13－15］等方面。多糖是软枣猕猴桃中主要成分之一，对其进行深入研究对于软枣猕猴桃的开发利用有重要意义。

本实验对微波辅助提取的软枣猕猴桃多糖进行分离纯化，并对各纯化组分的抗氧化活性进行了测定，以期为软枣猕猴桃多糖的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

软枣猕猴桃鲜果，采自辽宁省抚顺山区;DPPH，美国Sigma公司;DEAE-纤维素52，国药集团化学试剂有限公司;Sephadex G-100、Sephadex G-200，北京索莱宝科技有限公司;其余试剂为国产分析纯。

U-2910型紫外可见分光光度计，日立先端科技股份有限公司;Heto-LL 3000冻干机，赛默飞世尔科技公司;HC23B-AV型微波炉，上海新仪微波化学科技有限公司;5805型高速冷冻离心机，德国艾本德公司;RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;HL-2B数显恒流泵、BS-100A自动部份收集器，上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2 软枣猕猴桃多糖粗品的制备

软枣猕猴桃鲜果破碎后采用确定的乙醇除杂工艺:乙醇体积分数80%、料液比1∶2(g∶mL)、时间60 min，去除软枣猕猴桃果中大量的色素类杂质及还原糖，抽滤，弃去上清液，沉淀部分采用微波辅助提取工艺:料液比 1∶9(g∶mL)、微波处理时间 10 min、微波功率500 W进行提取，提取结束后，离心获得的上清液进行减压浓缩，然后用4倍体积的无水乙醇沉淀，4℃冷藏过夜，沉淀离心后依次用石油醚、丙酮、无水乙醇浸泡洗涤，抽滤后冷冻干燥，得微波辅助提取的软枣猕猴桃多糖粗品。

1.3 软枣猕猴桃多糖纯品的制备

1.3.1 DEAE-纤维素阴离子交换层析分离［16］

将软枣猕猴桃多糖粗品复溶(5 mg/mL)，其水溶液经DEAE-纤维素柱层析(d 1.6 cm×30 cm)，每次上样10 mL，依次用蒸馏水、0～1 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速度为1.25 mL/min，每管5 mL分部收集，逐管检测多糖含量(苯酚-硫酸法A490)、蛋白质含量(紫外A280)、核酸含量(紫外A260)，分别收集单一峰组分，透析脱盐浓缩后，备用。

1.3.2 SephadexG-100凝聚柱层析纯化

将DEAE-cellulose-52层析柱分离得到的软枣猕猴桃多糖组分经SephadexG-100(φ1.0 cm×40 cm)凝胶柱进行纯化。凝胶层析柱先用0.1 mol/L NaCl溶液平衡48 h，再以0.1 mol/L NaCl溶液进行洗脱，每次上样5 mL，流速为0.5 mL/min，每管5 mL分部收集，逐管检测多糖含量(苯酚-硫酸法A490)和蛋白质含量(紫外A280)，分别收集单一峰组分，透析脱盐浓缩后，备用。

1.3.3 SephadexG-200凝聚柱层析纯化

将SephadexG-100层析柱纯化得到的软枣猕猴桃多糖组分经SephadexG-200(φ1.0 cm×40 cm)凝胶柱进一步纯化。凝胶层析柱先用0.1mol/L NaCl溶液平衡48h，再以0.1mol/L NaCl溶液进行洗脱，每次上样4 mL，流速为0.25 mL/min，每管4 mL分部收集，逐管检测多糖含量(苯酚-硫酸法A490)和蛋白质含量(紫外A280)，分别收集单一峰组分，透析脱盐浓缩后，冷冻干燥，得软枣猕猴桃多糖纯品，称量后备用。

1.4 软枣猕猴桃多糖纯品的抗氧化活性测定

1.4.1 DPPH自由基清除能力的测定

［17］，分别配制浓度为 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的软枣猕猴桃多糖纯品溶液1 mL，分别加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液3 mL，混匀后置暗处，室温反应30 min后，以蒸馏水调零点，在517 nm处测定空白管的吸光值AC、样品管的吸光值AS，Vc为阳性对照。半抑制浓度IC50，根据浓度-清除率二维曲线上读取的清除率为50%时对应的浓度值计算［18］，按下列公式计算DPPH自由基的清除率。

式中:AC为空白管的吸光值;AS为样品管的吸光值。

1.4.2 羟基自由基(·OH)清除能力的测定

参考文献［19］分别配制浓度为 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的软枣猕猴桃多糖纯品溶液1 mL，分别加入10 mmol/L的FeSO41 mL，10 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL，最后加入8.8 mmol/L的H2O21 mL启动反应，37℃反应30 min，在510nm下测定空白管的吸光值AC、样品管的吸光值AS，Vc为阳性对照。半抑制浓度IC50，根据浓度-清除率二维曲线上读取的清除率为50%时对应的浓度值计算［16］，按下列公式计算羟基自由基的清除率。

式中:AC为空白管的吸光值;AS为样品管的吸光值。

1.4.3 超氧阴离子自由基(O－2·)清除能力的测定

参考文献［19］分别配制浓度为 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的软枣猕猴桃多糖纯品溶液1 mL，分别加入4.5 mL 50 mmol/L pH=8.2的Tris-HC1缓冲液，混匀，于25℃恒温水浴中保温20 min，取出后立即加入25 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL，迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5 min，加入8 mmol/L HCl 1 mL，终止反应，于320 nm处测定空白管的吸光值AC、样品管的吸光值AS，Vc为阳性对照，按下列公式计算超氧阴离子自由基的清除率。

式中:AC为空白管的吸光值;AS为样品管的吸光值。

2 结果与分析

2.1 软枣猕猴桃多糖的DEAE-cellulose-52阴离子交换层析结果

由图1可知，软枣猕猴桃多糖经DEAE-纤维素-52柱分离时，依次用水、0.1 NaCl、0.2、0.3 mol/L NaCl洗脱出4个组分，逐管检测多糖、蛋白质和核酸含量，结果表明，0.1 mol/L NaCl盐洗组分中含有少量的蛋白质和核酸，其余组分中均未检出。

图1 软枣猕猴桃多糖的DEAE-cellulose-52柱层析洗脱曲线Fig.1 DEAE-cellulose-52 anion-exchange column chromatogram of Actinidia arguta polysaccharide

2.2 SephadexG-100凝聚柱层析结果

由图2可知，经过阴离子交换柱层析得到的各多糖组分再经过SephadexG-100凝聚柱层析后，都是只得到一个洗脱峰且峰形比较对称。逐管检测蛋白质含量，结果表明每个组分中均含有极微量的蛋白。

图2 软枣猕猴桃多糖各组分SephadexG-100凝聚柱层析洗脱曲线Fig.2 SephadexG-100 column chromatogram of pure fractions after anion-exchange column separation

2.3 SephadexG-200凝聚柱层析结果

由图3可知，经过Sephadex G-100凝聚层析柱纯化后的各多糖组分再经过Sephadex G-200凝聚柱层析，依然只得到一个洗脱峰且峰形对称，说明经离子交换柱分离得到的每一部分为具有相同分子质量的同一组分，在凝胶柱上不再分离。逐管检测蛋白质含量，结果表明每个组分中都不含有蛋白质。收集各组分，以去离子水透析(截留MW14 kDa)，浓缩后冷冻干燥。经计算，水洗组分、0.1盐洗组分、0.2盐洗组分和0.3盐洗组分分别占总洗脱量的14.7%、50.2%、26.1%和9.0%，总回收率为82.4%。0.1盐洗组分为主要洗脱组分。

图3 软枣猕猴桃多糖各组分SephadexG-200凝聚柱层析洗脱曲线Fig.3 SephadexG-200 column chromatogram of pure fractions after SephadexG-100 column separation

2.4 软枣猕猴桃多糖各纯化组分抗氧化活性的测定

2.4.1 DPPH自由基清除能力的测定

由图4可知，随着样品浓度的增加，软枣猕猴桃多糖各纯化组分清除DPPH自由基的能力也逐渐增强，表现出明显的量-效关系。4个组分对DPPH自由基的清除能力为:0.1盐洗组分＞0.3盐洗组分＞0.2盐洗组分＞水洗组分，其中水洗组分的清除能力最弱，当该组分浓度为1.0 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率仅为9.6%。

图4 软枣猕猴桃多糖各纯化组分对DPPH自由基的清除率Fig.4 DPPH·-scavenging rate of pure fractions from Actinidia arguta polysaccharide

2.4.2 羟基自由基(·OH)清除能力的测定

由图5可知，软枣猕猴桃多糖水洗组分没有清除羟基自由基的能力，3个盐洗组分随着样品浓度的升高，对羟基自由基的清除能力逐渐增强，也表现出明显的量-效关系。3个盐洗组分对羟基自由基的清除能力为:0.1盐洗组分＞0.3盐洗组分＞0.2盐洗组分。

图5 软枣猕猴桃多糖各纯化组分对羟基自由基的清除率Fig.5 OH scavenging rate of pure fractions from Actinidia arguta polysaccharide

由图6可知，软枣猕猴桃多糖各纯化组分对超氧阴离子自由基的清除能力很弱。4个组分中0.3盐洗组分的清除能力最强，但当该组分浓度为2.5 mg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率只有20.3%。

图6 软枣猕猴桃多糖各纯化组分对超氧阴离子自由基的清除率 mg/mLFig.6 scavenging rate of pure fractions from Actinidia arguta polysaccharide

3个盐洗组分和阳性对照Vc清除DPPH自由基和羟基自由基的IC50见表1。

表1 软枣猕猴桃多糖3个盐洗组分与Vc抗氧化活性的比较Table 1 Comparison of antioxidant activity of three brine elution fractions and Vc

由表1可知，3个盐洗组分的抗氧化活性为:0.1盐洗组分＞0.3盐洗组分＞0.2盐洗组分，但与Vc相比，还有一定的差距。

3 结论

(1)微波辅助提取的软枣猕猴桃多糖经DEAE-纤维素层析分离得到4个组分:水洗组分、0.1盐洗组分、0.2盐洗组分和0.3盐洗组分，这4个组分经SephadexG-100、SephadexG-200凝聚柱层析进一步纯化，都是只得到一个洗脱峰且峰形对称，表明这4个组分都为均一多糖，经检测每个组分中都不含蛋白质。水洗组分、0.1盐洗组分、0.2盐洗组分和0.3盐洗组分分别占总洗脱量的14.7%、50.2%、26.1%和9.0%，总回收率为82.4%。0.1盐洗组分为主要洗脱组分。

(2)各纯化组分的抗氧化活性测定结果表明:软枣猕猴桃多糖具有一定清除DPPH自由基和羟基自由基的能力，对超氧阴离子自由基的清除能力很弱;盐洗组分的抗氧化活性明显优于水洗组分;3个盐洗组分中0.1盐洗组分的抗氧化活性最强，0.3盐洗组分次之，0.2盐洗组分最弱;0.1盐洗组分为软枣猕猴桃多糖中主要的抗氧化活性组分。

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