黄酒中生物胺的形成及其影响因素*

张凤杰，薛洁，王异静，王德良，周建弟，谢广发

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100027)2(浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司，浙江绍兴，31200)

黄酒是以谷物为原料，由多种微生物(霉菌、酵母和细菌)共同参与酿制而成的一种低酒精度发酵酒，是中华民族的国粹之一。作为中国特有的传统酒种，其独特的开放式多菌种发酵技术，完全不同于葡萄酒等采用单一菌株发酵的饮料酒，多菌种发酵虽然造就了黄酒酒体风味醇厚、丰满、完整和馥香的特点，但发酵过程复杂且难以控制，易产生一些潜在的有害物质，生物胺就是其中之一［1－5］。

生物胺是一类碱性含氮化合物，因其潜在的毒性作用和对生产卫生条件的指示作用而受到消费者、制造商和研究者的关注。食用含高浓度生物胺的食品后，会引起一系列不良反应，如头痛。其中组胺的毒性最大，其次是酪胺。口服8～40 mg组胺会产生轻微中毒症状，超过40 mg会产生中等中毒症状，超过100 mg会产生严重中毒症状;酪胺的最大摄入量为100～800 mg/kg，超过1 080 mg/kg会引起严重中毒。哺乳动物的肠道和消化道具有一定的解毒功能，在酶的作用下单胺或多胺的氨基被氧化，从而达到解毒的作用，但酒精和乙醛抑制这些酶的活性［6－10］。

目前，对黄酒生物胺的研究多集中于检测分析方面，对黄酒酿造过程中生物胺的产生和影响因素分析报道较少。根据资料报道，我国葡萄酒中生物胺含量在6.34～39.05 mg/L之间，啤酒中生物胺含量范围为2.20 ～42.03 mg/L［11］，而黄酒中生物胺的平均含量却达到115 mg/L［1］，因此，黄酒中生物胺含量远远高于葡萄酒和啤酒。作为中国民族特色产品，我国黄酒产品国际市场占有率极低，因此如何提高黄酒质量安全水平，加强黄酒安全监控，是提高我国黄酒产品国际竞争力的关键之一。本研究通过分析原料、菌种、发酵工艺及贮存时间对黄酒中生物胺含量的影响，探究黄酒生物胺含量的变化规律，为进一步控制黄酒中生物胺含量提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料及仪器设备

1.1.1 实验材料

糯米、麦曲、酒母、发酵醪、黄酒样品，由浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司提供。

1.1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(Agilent1100，Perkin Elmer Series 200，配紫外检测器);离心机;旋涡混合器;恒温箱;氮吹仪;超声波清洗器;分析天平(精确至0.000 1 g);pH计;超纯水器;0.45 μm针头微孔滤膜过滤器。

1.1.3 主要化学试剂

8种单体生物胺标样(色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺)，18 种氨基酸标样，1，7二氨基庚烷(内标)，丹磺酰氯(衍生剂)，均为Sigma公司产品;异硫氰酸苯酯，三乙胺，三氯甲烷，正丁醇，正己烷，三氯乙酸，丙酮，甲醇，乙腈，均为色谱纯。

1.2 分析方法

1.2.1 样品前处理和生物胺测定方法：

参照GB/T 5009.208－2008食品中生物胺含量的测定［12］。

1.2.2 氨基酸的测定方法

采用PITC柱前衍生高效液相色谱法［13］。

1.2.3 酒精度、总酸、的测定

参照GB/T13662－2008黄酒国家标准［14］。

1.2.4 细菌计数方法

采用细菌平板菌落计数法，将黄酒发酵液梯度稀释至 10－5，10－6，10－7，分别接种于改良 MRS 固体培养基上［15］，30℃厌氧培养2 d后进行计数。

1.3 感官品评

1.3.1 品评人员

国家级或省级黄酒评委。

1.3.2 品评依据

根据理化指标初步确定候选的批次和缸别，取上清液，分别装在三角瓶中，在电炉上加热至刚沸腾并有大气泡，移去热源，稍冷后倒入各组(6个)酒杯中;通过品评人员对其澄清度和感官品质进行评价来划分质量。即澄清度好则发酵成熟，浑浊或产生沉淀则发酵尚不成熟;口味以暴辣、爽口、无异味为佳［16］。

1.4 数据处理

应用Origin8.5作图和SPSS10.0进行相关性分析和单因素方差分析，P＜0.05视为差异显著。

2 结果分析

2.1 原料和糖化发酵剂中生物胺含量及影响分析

绍兴黄酒酿造是以糯米为原料，以块曲和熟曲为糖化剂，以速酿酒母(机械化新工艺黄酒)或淋饭酒母(传统工艺黄酒)为发酵剂。本研究选取黄酒酿造用水、3种不同产区的粳糯米、3种不同产区的籼糯米、3种麦曲、7种淋饭酒母和1种速酿酒母共18个样品，检测其生物胺含量，结果如表1、表2所示。

表1 黄酒酿造原料中生物胺含量mg/LTable 1 Content of biogenic amines in glutinous rices mg/L

从表1结果可以看出:水中不含生物胺;糯米中仅检出腐胺、尸胺和精胺3种脂肪族生物胺，它们的产生与卫生条件密切相关［17］。生物胺总量范围为0.14～6.01 mg/kg，其中腐胺含量比和检出率最大，尸胺仅在粳糯米3中检出。3种粳糯米中生物胺含量差异显著(P＜0.05)，3种籼糯米无显著差异。

从表2结果可以看出:曲中检出少量生物胺，总含量不超过1.00 mg/kg，其中腐胺含量比和检出率最大;酒母中除组胺和酪胺在少量样品中未检出外，8种胺均被检出，且不同酒母生物胺含量差异显著(P＜0.05)，变化范围为16.43～87.72 mg/L。腐胺是酒母中的主要生物胺，含量占19.83～68.23%，差异极显著(P＜0.01)。色胺在淋饭酒母中的平均含量为12.16 mg/L，酪胺仅为3.72 mg/L。

表2 黄酒酿造不同曲和酒母中生物胺含量mg/LTable 2 Content of biogenic amines in“wheat Qu”and seed starters mg/L

续表2

按照黄酒机械化生产的原料配比和表2中总量平均值计算，糯米、曲、酒母带入黄酒的生物胺约为1.22 mg/L、0.11 mg/L、6.03 mg/L，因此，酒母带入前酵罐的生物胺总量最大，其次是糯米，曲带入的极少。

酒母的优劣是决定黄酒酿造中发酵好坏的关键，也与黄酒风味有着重要的关系。成熟的淋饭酒母需经过挑选后才能使用，通常采用化学分析和感官鉴定相结合的方法进行挑选:发酵正常、酒精度15%以上、总酸6.1g/L以下、爽口无异味的淋饭酒母为优良酒母。同样，酒精度9.0%以上、总酸4.1g/L以下的速酿酒母为成熟酒母［16］。8种不同酒母的化学分析和感官鉴定结果见表3，7种淋饭酒母中生物胺总量与总酸、酒精度和感官品评的相关性分析结果见表4。

表3 不同酒母的化学分析和感官鉴定Table 3 The chemical analysis and sensory analysis of seed starters

表4 淋饭酒母中生物胺总量与总酸、酒精度和感官品评的相关性分析Table 4 The correlation analysis between content of biogenic amines and total acid，alcohol，sensory analysis

结果表明，生物胺总量与总酸含量呈正显著相关，与酒精度和感官品质呈负显著相关，其中与总酸和酒精度的相关性极显著，这说明总酸较低、酒精度偏高、感官品评好的淋饭酒母中生物胺含量较少。所以，挑选良好的淋饭酒母不仅能够保证生产的顺利进行，而且也是控制发酵前生物胺含量的关键措施之一。

2.2 黄酒发酵过程中生物胺含量变化及因素分析

传统的黄酒酿造工艺是以陶制的大缸和陶坛为发酵容器，摊饭操作、手工开耙，全开放式发酵。前酵在大缸中进行，发酵到约第4天将发酵醪分装到陶坛中，进行缓慢的后发酵，发酵期长达70～80 d。机械化的黄酒酿造工艺用发酵罐代替了陶缸和陶坛，机械设备代替了手工操作，控温发酵，发酵时间缩短到20 d左右。本研究分别跟踪两种工艺发酵过程中生物胺含量的变化，结果见图1所示。

图1 传统和机械化工艺发酵过程生物胺总量变化曲线Fig.1 Change of biogenic amines content duiring two kinds of different fermentation processes

图1显示，2种不同工艺酿造过程中生物胺总量均呈先上升后下降的趋势。机械化工艺在第6天达到最高值，总量的增加表现为前急后缓，发酵结束后生物胺总量是发酵前的286.21%。传统工艺发酵过程，发酵第2天生物胺总量已经很高，到15 d时达到最大值，此值比机械化工艺最大值高27.8 mg/L，之后呈降低趋势，发酵结束后生物胺含量为110.07 mg/L，与机械化工艺发酵结束时生物胺含量(104.18 mg/L)大致相同。另外本研究分析结果表明，腐胺是黄酒中的主要生物胺，占生物胺总量20.46% ～54.43%(机械化工艺)，31.74% ～50.13%(传统工艺);酪胺是另一个主要生物胺，机械化黄酒中最高含量为(50.70±2.32)mg/L，传统工艺为65.66±2.01 mg/L，其他生物胺在2种不同工艺黄酒中也存在差异，如色胺的差异很大，在传统工艺黄酒中相对较高，最高含量为(37.68±2.04)mg/L，而在机械化工艺中仅为(10.81±1.75)mg/L，可能与传统工艺中更为复杂的微生物群落有关。

生物胺是由相应前体物氨基酸在脱缩酶作用下经过脱羧反应转化而来［18］，因此前体物浓度影响生物胺的含量，本研究跟踪了黄酒发酵过程中生物胺和氨基酸变化，如图2所示。

黄酒发酵过程中氨基酸含量的变化是一个动态过程:一方面，蛋白酶不断水解蛋白质成氨基酸，并且在发酵后期，酵母等微生物自溶后内容物析出，氨基酸含量增加;另一方面酵母生长发酵，消耗部分氨基酸，但从图2结果可知，在发酵过程中黄酒中氨基酸含量呈显著的上升趋势，而酪胺等生物胺均呈现先增多后降低，这从一定程度上说明黄酒中氨基酸含量多少不是限制生物胺合成的条件;对前6天酪胺和酪氨酸变化情况进行相关性分析，相关系数r=0.974*，P=0.005，这仅能说明发酵前6 d两者成线性正相关;而从氨基酸总量和生物胺总量来看，并无相关性。因此，可以判断黄酒发酵过程中氨基酸含量丰富，不影响生物胺的生成，这与张辉［19］的研究结论相一致。

图2 酪胺与酪氨酸，生物胺总量与氨基酸总量变化曲线(氨基酸总量以10 mg/L为单位计算)Fig.2 Change of tyramine and tyrosine content(a)，change of biogenic amines and amino acids content(b)

乳酸菌是发酵过程中影响生物胺含量的另一个关键因素［18，20］，黄酒发酵醪中乳酸菌主要是来自酒母和麦曲，少部分从器具和环境中接入［16］。由于乳酸菌是黄酒酿造中的主要细菌［19，21］，本研究分析了机械化黄酒发酵过程中细菌数量的变化情况，如图3所示。

图3 机械化工艺发酵过程中细菌数目变化曲线Fig.3 Changes of bacterial count in mechanized fermentation process

结果显示，发酵前2 d细菌数量急剧增多;但随着酒精度、总酸的升高，温度的降低和酵母菌的相互抑制作用等，细菌数目大幅减少，至第6天降到0.13×107个，之后几乎保持稳定。这一变化趋势与机械化黄酒发酵过程中生物胺变化趋势相吻合，这也说明了降低黄酒中产生物胺微生物数量是控制生物胺含量的关键［22］。

生物胺的降低与生物胺被微生物还原利用及其他化学还原有关。微生物体内广泛存在单胺和多胺氧化酶，该酶介导生物胺氧化生成醛，其活性受酸和氧气的抑制［23－25］。黄酒前酵过程中间隔开耙，使其溶氧增多，抑制了该酶的作用，但后酵过程不管是在陶坛还是在大罐中，都不再开耙，随着微生物的代谢，发酵醪中的溶氧越来越少，抑制作用减弱，这就可以解释黄酒发酵过程中生物胺的不规则降低。另外，研究者从绍兴黄酒等酒精性饮料中检测到4-methylspinaceamine，该物质是乙醛与组胺的缩合反应产物［26］;研究还发现Lactobacillus sp.(30a和w53)含有利用组胺的操纵子［27］。

2.3 陈酿时间对黄酒中生物胺含量的影响

测定A、B、C 3个厂的部分年份酒生物胺含量(A、B厂为传统工艺年份酒，C厂为机械化工艺年份酒)，结果见图4。

图4 A、B、C 3个厂家年份酒生物胺含量Fig.4 The content of biogenic amines in aging wines from three factories

从图4中生物胺总量变化来看，传统工艺酿制黄酒越陈，生物胺含量越低，而机械化年份酒没有规律性变化，这说明在生物胺危害性方面，传统工艺发酵黄酒的陈酿价值要优于机械化黄酒;以3个厂第3年的年份酒来看，机械化工艺的生物胺总量较传统工艺低;腐胺、酪胺依旧是黄酒中的主要生物胺，不因厂家和年份而改变，3个厂的平均比例依次是:83.94%，79.04%，68.03%。但样品并非同一批样品，初始值本身存在差异。

3 小结与讨论

本文分析了黄酒酿造过程中生物胺、氨基酸和乳酸菌的动态变化，研究表明:

(1)糯米原料和曲对黄酒生物胺影响很小，仅检出腐胺、尸胺和精胺，但总量不超过6.01 mg/L。酒母对黄酒生物胺的影响较大，酒母中生物胺总量与总酸、酒精度呈极显著正相关关系，与感官品质呈显著负相关关系。

(2)黄酒酿造过程中含量最多的生物胺是腐胺，其次是酪胺;组胺的检出率很高，但含量极少超过10.00 mg/L;色胺在传统工艺过程中所占比例较机械化工艺高。

(3)发酵过程对黄酒生物胺的影响最大，传统和机械化两种工艺差异明显，前者较后者生物胺含量高，这可能与其复杂的微生物菌落有关。长时间后酵和陈酿会降低生物胺含量，缩小两者的差距。

(4)作为生物胺前体物质的游离氨基酸随发酵时间含量逐渐增多，丰富的氨基酸不是限制发酵过程中生物胺形成的因素。生物胺先增多后降低且“前急后缓”的趋势说明:产生物胺的复杂菌群随基质条件的变化而相应变化是生物胺形成的关键。

基于上述结果，本文提出以下控制生物胺形成或降低生物胺含量的措施:

(1)生产上选用总酸较低、酒精度偏高、感官品评好的淋饭酒母可有效降低黄酒中生物胺含量。在实际生产的基础上，适当延长后酵和陈酿时间也可以降低生物胺含量。

(2)由于黄酒发酵醪中乳酸菌产生物胺的能力存在差异，所以在生产上控制产生物胺能力强的菌株，或接种不产(低产)生物胺的菌株来完成发酵，是从根本上控制生物胺形成的有效方法之一。

(3)研究证明微生物体内广泛存在单胺和多胺氧化酶，组胺和酪胺氧化酶的作用阻止了食品中的组胺和酪胺的积聚。因此，在生产上添加氧化酶或者利用特殊菌群间的相互作用可能会降低生物胺的含量。

(4)黄酒本身是一个成分复杂的不稳定胶体，不同酒样有自己稳定的pH值和等电点，打破胶体的平衡，某些成分会析出以达到新的平衡。是否可以利用此手段来降低黄酒中生物胺含量还需要进一步研究。

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