ROL酶解制备富含甘油二酯的大豆油工艺的优化

张梦柯 石 波 李 颖 李 超 左剑南 程永强

ZHANGMeng-ke1 SHIBo2 LI Ying3 LIChao1 ZUO Jian-nan1 CHENG Yong-qiang1

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院植物源功能食品北京市重点实验室，北京 100083；2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；3.中国农业大学生物学院，北京 100083）

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing 100081,China;3.College of Biological Sciences,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

甘油二酯（diacylglycerol，DAG）是甘油三酯（triacylglycerol，TAG）中一个脂肪酸被羟基所取代的结构脂质,有1,2-DAG和1,3-DAG两种同分异构体[1]。DAG是油脂的天然组成成分，但含量很低，通常不超过10%[2]。DAG与TAG具有相似的口感、色泽、风味、质地和能量值（DAG为38.9 kJ/g，TAG为39.6 kJ/g）[3,4]。研究表明，不饱和脂肪酸型的甘油二酯具有抑制脂肪在动物和人体内积累的功能[5-7]，这主要是因为DAG，尤其是1,3-DAG，在小肠内不能降解为 2-单甘酯（monoglyceride，MAG），这些生理差异使甘油二酯的餐后血脂降低，体内脂肪酸氧化速率加快[8]。甘油二酯的这些功能和特点使其作为一种安全健康的食用油[9]，在日本及美国的市场上深受广大消费者的欢迎。

近年来，中国在甘油二酯的生产工艺上进行了一些研究，主要有化学合成法，生物酶合成法（包括油脂水解法、油脂醇解法、直接酯化法和油脂甘油解法）和微生物发酵法[10]，其中利用脂肪酶催化生产甘油二酯，具有反应条件温和、生产得率高、产品品质高、环境污染小等优点,是最具应用前景的生产工艺。然而脂肪酶催化水解制备甘油二酯的文献报道并不多，因此本试验以大豆油为材料，对3种不同脂肪酶进行了系统的筛选，并进一步对其中最优的脂肪酶催化水解制备富含甘油二酯的工艺条件进行优化，旨在为实现甘油二酯的工业化生产提供一定的研究基础和参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

大豆油：福临门大豆油，市售；

RML、ROL和ALIP脂肪酶：中国农业大学生物学院提供；

1，3-二亚油酸甘油酯标样：美国Sigma公司

乙腈、异丙醇、甲酸：色谱纯，美国Fisher公司；

1.2 主要试验设备

分析天平：AR2140型，美国奥豪斯公司；

磁力搅拌器：RTC basic型，德国IKA公司；

示差折光检测器：2944型，美国Waters公司；

高压输液泵：2695型，美国Waters公司；

恒温培养振荡器：ZHWY-200D型，上海智诚分析仪器制造有限公司；

色谱柱：Sunchrom ODSC18（4.6mm×250mm，5μm）型，北京金欧亚有限公司；

高速离心机：HC-2518型，科大创新股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理 称取2.5 g大豆油于 50 mL的锥形瓶中，并将其置于恒温培养箱中，预热至设定温度后，加入一定量的酶液和水，用恒温培养振荡器在一定的搅拌速度下，反应一定的时间。反应结束后，反应液沸水灭活10min，冷却后离心10min，取上清液进行分析。

1.3.2 分析方法

(1)样品前处理：从大豆油原料及上述反应产物中的上清液里取少量样品，用流动相溶解样品配制浓度为10mg/mL。取1.5mL过0.45μm有机膜于进样瓶中。

(2)甘油二酯的组成测定：采用高效液相（HPLC）测定。检测条件：乙腈—异丙醇（70/30，V/V）流动相等度洗脱；流动相流速为1.0 mL/min；检测器温度30℃；柱温30℃；样品进样量20μL；示差检测器检测；面积归一化法定量。因为大豆油酶解后产物中甘油二酯是混合物，成分比较复杂，其中还包括DAG的异构体，所以不可能通过商业渠道购买所有DAG的标准样品用来确定产物中每一种DAG的含量[11]。大豆油中甘油三酯主要是 LLL，LLO，LLP，OLO 和 PLO[12]，理论上讲，甘油二酯产物中二亚油酸甘油酯的含量应该相对较多，故本试验用酶解产物中1，3-亚油酸甘油酯作为定量分析酶解产物中甘油二酯含量的一个指标。

(3)数据处理：每个条件做3次平行试验，取平均值进行结果分析。

1.3.3 单因素试验

(1)不同酶催化下反应时间对酶催化水解产生甘油二酯含量的影响：在温度35℃、含水量28.57%、加酶量20 U/g、搅拌速度150 r/min的条件下，以酶解产物中1，3-二亚油酸甘油酯为衡量指标，考察不同脂肪酶催化下大豆油酶解反应情况。

(2)反应温度对酶催化水解产生甘油二酯含量的影响：在时间4 h、含水量 28.57%、加酶量64 U/g、搅拌速度150 r/min的条件下，考察温度对酶催化水解反应效率的影响。

(3)加酶量对酶催化水解产生甘油二酯含量的影响：在温度30℃、时间4 h、含水量 70.59%、搅拌速度150 r/min的条件下，考察加酶量对酶催化水解反应效率的影响。

(4)含水量对酶催化水解产生甘油二酯含量的影响：在温度30℃、时间4 h、加酶量64 U/g、搅拌速度150 r/min的条件下，考察含水量对酶催化水解反应效率的影响。

(5)搅拌方式及转速对酶催化水解产生甘油二酯含量的影响：在温度30℃、时间4 h、加酶量64 U/g、含水量28.57%的条件下，考察不同搅拌速度对酶催化大豆油水解效率的影响，同时对比了恒温振荡箱和磁力搅拌器两种搅拌方式对反应效率的影响。

2 结果与讨论

2.1 试验用酶的筛选

采用脂肪酶（RML，ROL和ALIP），分别测定了在不同酶的催化下生成的1，3-二亚油酸甘油酯的含量随催化时间的变化，其结果见图1。

图1 不同酶催化下反应时间对酶解反应效果的影响Figure 1 Influence of reaction time on enzymatic hydrolysis of different lipases

由图1可知，ALIP催化大豆油产生甘油二酯的能力最低，其主要原因可能是该酶无1，3位催化特异性。RML和ROL虽然都是1，3位特异性催化酶，但ROL的催化活性更高，其产物中1，3-二亚油酸甘油酯含量高达16%以上，且经4 h反应就基本达到平衡，所以后续研究选用ROL为试验用酶，反应4 h最佳。

2.2 反应温度对酶催化水解产生甘油二酯含量的影响

以ROL为催化剂，测定了水解产生的1，3-二亚油酸甘油酯的含量随反应温度的变化，其结果见图2。

由图2可知，随着反应温度的升高，酶催化水解大豆油的反应效率在 25～45℃的温度范围内几乎没有太大变化。这说明ROL在一定范围内对温度的变化不敏感。在反应温度上升到50℃之后，酶的催化效率随着温度的升高而迅速降低，到60℃时，酶的催化活性已经很低了。这是因为一定范围内温度的增加可以减少混合物的黏度，提高溶解度和改善底物的扩散过程，从而减少传质的限制，有利于酶与底物之间的相互作用[13]；然而由于酶是具有生物活性的大分子物质，过高的温度会使酶催化中心的空间构象发生了不可逆的变化，酶的催化活性降低甚至失活。从实际生产的角度考虑，反应温度取30℃最为适宜。

图2 温度对酶解反应效果的影响Figure 2 Influence of reaction time on enzymatic hydrolysis

2.3 加酶量对酶催化水解产生甘油二酯含量的影响

以ROL为催化剂，测定了水解产生的1，3-二亚油酸甘油酯的含量随加酶量的变化，其结果见图3。

图3 加酶量对酶解反应效果的影响Figure 3 Influence of enzyme load on enzymatic hydrolysis

由图3可知，随着酶量的增加，酶的催化效率逐渐提高，但当加酶量超过64 U/g时，反应产物中甘油二酯的含量几乎不再变化。这主要是因为在一定的范围内，酶浓度的增加使反应体系中的酶分子有更多的活性部位与底物接触，反应效率提高；但是当酶活性部位过量时，将有可能由于蛋白的聚集作用而不再与底物接触[14]，从而不能继续加快反应速率。在加酶量为64 U/g时，反应达到饱和，反应体系处于平衡状态。故加酶量64 U/g为最佳。

2.4 含水量对酶催化水解产生甘油二酯含量的影响

以ROL为催化剂，测定了水解产生的1，3-二亚油酸甘油酯的含量随反应体系中含水量的变化，其结果见图4。

脂肪酶是在油水界面上发挥催化作用的酶，水是维持酶活性的必备条件，含水量过低，则会影响酶分子表面的单分子层，使酶分子的构象和活性受到影响[15]，所以含水量是一个重要的影响因素。由图4可知，随着含水量的增加，酶解产物中甘油二酯的含量逐渐降低。这主要是因为酶促水解体系中液体酶中的水已经满足酶的催化作用，多余的水打破了水—油界面的平衡，随着水界面的增大,酶分子与油界面的接触机会减少，催化效率下降。故后续试验中不再向反应体系额外添加水。

图4 含水量对酶解反应效果的影响Figure 4 Influence ofwater content on enzymatic hydrolysis

2.5 搅拌方式及转速对酶催化水解产生甘油二酯含量的影响

以ROL为催化剂，分别测定了不同搅拌方式下水解产生的1，3-二亚油酸甘油酯的含量随搅拌速度的变化，其结果见图5和图6。

图5 恒温振荡箱振荡速度对酶解反应效果的影响Figure 5 Influence of constant temperature vibrator agitation speed on enzymatic hydrolysis

图6 磁力搅拌器转子转速对酶解反应效果的影响Figure 6 Influence ofmagnetic stirrer agitation speed on enzymatic hydrolysis

由图5和图6可知，在一定范围内，随着搅拌速度的增大，酶催化反应效率提高。这是因为搅拌速度的增大，增加了酶与水—油反应界面的接触面积，从而提高了酶的催化效率。但随着搅拌速度的进一步增大，反应效率反而降低，这可能是因为：①酶与反应界面的充分接触，促使酶进一步催化甘油二酯水解为单甘脂和游离脂肪酸，从而使体系中甘油二酯的含量降低；②过高的转速使转子在搅拌过程中产生的不良剪切效应破坏了酶分子的空间构象，使其催化活性降低[16]。两种不同搅拌方式的结果对比发现，振荡箱进行搅拌时，1，3-二亚油酸甘油酯的含量不高，为16.96%。磁力搅拌要明显优于恒温振荡箱搅拌，1，3-亚油酸甘油酯的含量为23.91%，提高了9.65%。这主要是因为磁力搅拌器转子产生的剪切力使底物与酶的接触更加均匀充分，从而提高了酶的催化效率。故选用磁力搅拌的方式，搅拌速度为500 r/min最佳。

根据HPLC-RID对最优条件下甘油二酯中各组分的检测，通过不带校正因子的面积归一化法[17]算出甘油二酯的含量高达55.5%。马传国等[18]利用Novozym435酶，在6.5 h，85℃下甘油二酯的得率为50.44%，与此相比，ROL用时更短，温度要求相对温和，得率也相对更高，更具有实现甘油二酯商业化生产的潜力。

3 结论

(1)选用脂肪酶ROL催化大豆油水解产生甘油二酯，2.5 g大豆油中加入64 U/g ROL酶液，在磁力搅拌器的转子转速为500 r/min，反应温度为30℃，反应时间为4 h的条件下，产物中1,3-二亚油酸甘油酯含量最高，为23.91%。

(2)该方法得到的产物中除了高含量的甘油二酯之外，还伴随有游离脂肪酸和单甘酯的生成，这些物质的存在会影响富含甘油二酯的大豆油的稳定性，如何在原有的基础上进一步促使这些物质转化为甘油二酯，是接下来的研究方向和重点。

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