十大技术之一（一）西瓜资源与品种核酸指纹鉴定关键技术

张海英 许勇

当前西瓜生产中种子质量问题比较突出和普遍，种子纯度不够和假种子坑农事件常有发生，常规的品种审定/鉴定主要以形态学特征为依据，鉴定周期较长，长达3—4个月，因此，急需建立早期、快速、准确的西瓜种子纯度和品种真实性检测技术。

1 技术概述

在西瓜全基因组测序与重测序的研究基础上，研发了一套最大限度准确反映西瓜品种资源多样性与遗传亲缘关系23对SSR核心引物序列，并利用核心引物建立1 300多个西瓜种质资源的核酸指纹库（图1、表1）。图1、表1显示分析结果基本一致。

2 技术要点

1）DNA提取：取植株下胚轴或幼叶30～40 mg，CTAB法或碱法快速提取DNA。

2）PCR扩增体系：每种dNTP 0.25 mmol·L-1， 正向引物0.2 μmol·L-1，反向引物0.2 μmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，10×PCR缓冲液（含Mg2+），样品DNA 60 ng，其余以超纯水补足。推荐使用15或20 μL反应体积。

3）PCR扩增程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸15 s，循环34次；最后72 ℃ 延伸4 min。10 ℃ 保温待用。

4）PCR产物检测：8% 聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳分离，采用快速银染法显色。

3 技术实施效果

3.1 西瓜品种纯度和真实性分析

利用SSR核心引物组合，可有效区分95%以上的供试育种材料，特别是对于来源于共同祖先的親缘关系极近的材料，其外观表型性状极其相近，采用常规田间种植观察较难准确区分，如京欣类型材料97103和98R，二者果实外观、植株形态等极似，但引物BVWS00106可以有效区分二者（图2）。目前，采用SSR核心引物组合，已对本中心育成的京欣2号、京阑、京玲、华欣等西瓜新品种进行了纯度鉴定，分子鉴定和田间鉴定吻合率达95%以上（图3）。

3.2 西瓜育种材料遗传背景分析

利用筛选得到的SSR核心引物组合对 17份重测序材料和100份西瓜育种材料进行聚类分析，聚类结果与供试材料系谱相对照，基本反映出了供试材料种质资源亲缘关系的远近。该分类结果从DNA水平上体现了这些种质资源的亲缘关系，可以为西瓜育种亲本选择提供理论依据（图4）。