肉鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定

孙艳红

引言

鸡大肠杆菌病是指由禽致病性大肠杆菌所引起的局部或全身感染的疾病，大肠杆菌病在哺乳动物主要引起肠道疾病，而在禽类当宿主受到致病性大肠杆菌感染而其防御能力不足以抵抗或完全丧失时，常会引起典型的继发性局部或全身性感染。此病可引起鸡的胚胎死亡、脐炎、败血症等一系列病症。由于大肠杆菌抗原复杂、血清型众多且易形成耐药性，给该病的预防造成很大困难。随着我国养鸡业集约化的迅速提高，鸡大肠杆菌病的流行势头也愈加猛烈。继发感染其他疾病或混合感染，使本病的发病率和死亡率明显升高，以及大量的药物、疫苗和人工费用等的支出，给养禽业造成了巨大的损失。本文对河北省永清县肉鸡致病性大肠杆菌进行了分离、鉴定、药敏试验及动物实验等，以为最终成功预防控制该病提供参考。

1、实验材料与方法

病料：无菌采取发病肉鸡的心脏、肝脏、肺等脏器。

培养基及生化试剂：普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基，伊红美蓝琼脂培养基、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇、肌醇等细菌生化微量鉴定管，VP试剂甲液、乙液。

抗菌药物：阿莫西林、头孢噻肟、新霉素、强力霉素、替米考星、环丙沙星、阿奇霉素、黏菌素、氟苯尼考、红霉素、四环素、痢菌净、泰妙菌素、林可霉素、头孢克肟、泰乐菌素；硫酸庆大霉素注射液。

药敏片：严格按照主要文献参考书中制备。

实验动物 ：昆明系小白鼠30只。雏鸡30只14日龄非免疫健康雏鸡，用于动物实验。

分离与培养：无菌钩取病料分别划线培养于营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板，37℃有氧培养24h。分离得到5株细菌分离株分别进行编号。

细菌纯化：鉴别培养后，分别挑取每个分离株的单个菌落接种于麦康凯培养基上，37℃培养18h，挑取单个菌落，经涂片染色，镜检，证实为纯培养物后，将纯培养物置4℃冰箱中备用。

生化试验：按常规方法对5株细菌分离物分别进行葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇、肌醇等糖发酵试验，VP试验，尿素、赖氨酸、水杨酸、枸橼酸盐利用试验，硫化氢试验。

溶血试验：参照文献描述方法进行。

药敏试验：采用纸片扩散法结果按抑菌圈直径大小作为判定敏感性的标准，20mm以上判为极敏；15～20mm判为高敏；10～14mm判为低敏；10mm以下判为耐药判定。

动物试验：制取5株细菌分离物，每个分离株都取细菌悬液原液稀释备用。

将30只小白鼠和30只雏鸡随机平均分为6组并分别进行编号，每组5只分别腹腔接种菌液，0.5mL/只。留取一组小白鼠和一组雏鸡腹腔接种相同剂量灭菌生理盐水做阴性对照。6组小鼠和雏鸡分别进行隔离饲养7d。接种后每天观察记录小鼠、雏鸡的精神、食欲、饮水、粪便、运动及死亡情况，死亡小鼠及雏鸡及时进行病理剖检及回归试验。

2、结果

细菌分离、生化试验结果 、溶血试验结果、溶血试验结果：从病料中共分离到5株细菌分离物，经培养特性观察、染色镜检、生化试验结果5株分离株符合大肠杆菌的特征，5株细菌分离物均为β-溶血。

药敏试验结果：5株分离菌对阿莫西林、红霉素、林可霉素和泰乐菌素的耐药性最高，余下依次为四环素、氟苯尼考、头孢噻肟、替米考星、环丙沙星、痢菌净、泰妙菌素、头孢克肟、强力霉素、阿奇霉素、庆大霉素、新霉素、黏菌素。分离菌表现出多重耐药性。

动物试验结果：细菌计数成功后用于动物实验。

人工接种小鼠实验：分别把小白鼠、雏鸡分六组，五组小白鼠和雏鸡进行接种留取一组，之后小白鼠和雏鸡分别在12h和24h出现大肠杆菌典型病症，无菌采取死亡小白鼠、雏鸡脾脏、肝脏等器官，划线接种普通琼脂平板，37℃培养24h，分离到与接种菌相同生物学特性的革兰氏阴性杆菌。结果表明5株大肠杆菌分离物对小鼠和雏鸡都具有高致病性。留取一组未接种的小白鼠和雏鸡整个实验观察期内均表现正常。

3、结论

本试验中，从病鸡病料分离到5株细菌分离物，根据培养特性观察、染色镜检、溶血试验和生化试验结果可将该菌株判定为大肠杆菌。送检的病鸡剖检病变特征有心包膜混浊，增厚，心包膜及心外膜上有纤维蛋白附着，白色；肝脏表面有一层白色纤维蛋白附着；气囊混浊，内有黏稠的黄色干酪样分泌物；肺部淤血水肿；腹腔脏器的表面覆盖一层淡黄色纤维素性渗出物。因此综合临床剖检病变和微生物学诊断结果可以初步判定送检病鸡为大肠杆菌感染病例。5株细菌分离物在各种培养基上的生长特性符合大肠杆菌生物学特性及细菌分离物对多种抗菌药物具有耐药性且对小白鼠和雏鸡具有致病性。

4、讨论

大肠杆菌病是临床常见的细菌性疾病之一，常常和其它细菌性和病毒性疾病并发，是目前危害我国畜牧业发展的一大难题。近些年来，随着集约化养殖程度的提高和抗菌药物的不合理使用等造成了大量的菌株出现了耐药性，有的抗菌药物甚至失效。因此，临床上应合理应用抗菌药物以避免或减少耐药性的产生。药敏试验一方面可以快速地检测病原菌对药物敏感程度，合理地指导临床用药；另一方面还可以作为大肠杆菌耐药性流行病学调查的一个重要参数，为准确地判断和分析大肠杆菌耐药的原因提供参考[6]。大肠杆菌对多种药物敏感，但极易产生耐药性[7]；为了防治大肠杆菌病，鸡场经常应用大量的抗生素，导致了细菌耐药性的增加，为该病的防治带来了极大困难[8]。建议各地区治疗鸡大肠杆菌病时要定期轮换用药，最好先进行药敏试验，选出敏感药物进行有效治疗，避免因盲目用药造成经济损失[9、10]。

大肠杆菌病是一种以大肠埃希氏菌引起的传染病，在自然条件下，可发生在不同日龄的鸡，但雏鸡更易感[11]。本病一年四季均有发生，但以冬春寒冷和气温多变季节多发近年来，鸡大肠杆菌病在河北省永清县养殖场及散养户中频繁发生，且有发病早、流行快、抗药性强、死亡率高及混合感染等特点，为了控制该病的发生，最大程度地减少经济损失，应严格鸡舍内环境卫生，加强消毒、通风换气，以及防止饲料污染，保持舍内温度的恒定。