高效液相色谱法检测鱼肉组织中金霉素、多西环素、米诺环素的残留

谈暠媛

摘要：建立了鱼肉组织中金霉素、多西环素、米诺环素的多残留检测的高效液相色谱法（HPLC）。样品经0.1 mol/LEDTA-McIlvaine缓冲液（pH 4.0）提取离心后，上清液用Oasis HLB固相萃取小柱净化，选用安捷伦Eclipse plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，粒径5μm），以乙腈：甲醇：0.01 mol/L草酸溶液（2﹕1﹕7）为流动相，流速0.5 mL/min，350 nm波长处测定，外标法定量。其3种药物浓度在25～200 ng/mL时均与峰面积呈良好的线性关系。结果表明，3种目标物质在鱼肉组织中的检测限为25 μg/kg，定量限为50 μg/kg。在不同浓度添加水平下测定，平均回收率在76.5%～89.1%，批内、批间变异系数均在10.00%以内。

关键词：金霉素；多西环素；米诺环素；多残留；高效液相色谱法（HPLC）

中图分类号：TS254.7 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）06-0017-05

四环素类（Tetracyclines，TCs）药物是由放线菌产生的一类广谱抗生素，对革兰氏阳性和阴性细菌、立克次氏体等均有很好的抑菌作用，常被用于畜、禽和水产养殖中[1]。目前国内四环素类抗生素主要包括六种：金霉素、土霉素、四环素、强力霉素（多西环素）、美他环素和米诺环素。

本文针对3种四环素类抗生素药物的特性，研究其在鱼肉中的多残留检测方法。方法采用高效液相色谱法，其具有选择性高、分离效果好、检测灵敏度高等优点，其准确度和回收率均能满足国家规定的对四环素类药物残留限量的要求，具有较好的通用性和推广性。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Waters2695高效液相色谱仪 （配2487型紫外检测器）；分析天平；回旋振荡器；旋涡混合器；数显恒温水浴锅；高速冷冻离心机；氮吹仪；Waters Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL）

1.2 药品与试剂

金霉素（CTC）、多西环素（DC）、米诺环素（MINO）标准品含量均大于80.0%。草酸、无水磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四醋酸二钠均为分析纯；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为重蒸馏水。

1.3 溶液的配制

标准储备液的配制：分别精密称取金霉素、多西环素、米诺环素的标准品10.00 mg，用适量甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶，配成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液，置于0 ℃冰箱中冷藏避光保存。保存期为1个月。

混合标准工作液的配制：用流动相稀释成适当浓度的标准工作液，现配现用。

0.01 mol/L草酸水溶液的配制：称取草酸1.26 g，加水溶解，稀释到1 000 mL。

0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH4.0）的配制：称取无水磷酸氢二钠28.4 g，加水溶解，稀释到1 000 mL。称取柠檬酸21.0 g，加水溶解，稀释到1 000mL。将上述磷酸氢二钠溶液625 mL和柠檬酸溶液1 000mL混合，加入乙二胺四醋酸二钠60.5 g，使其溶解，摇匀。必要时，用0.1 mol/L盐酸溶液或0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.0±0.05。

洗脱液（0.01 mol/L草酸-甲醇溶液）的配制：称取草酸1.26 g，加甲醇溶解，稀释到1 000 mL。

1.4 试验方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱∶ 安捷伦Eclipse plus C18：250 mm×4.6 mm，粒径5 μm；流动相∶乙腈∶甲醇∶ 0.01mol/L草酸溶液（用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至2.5）=2∶1∶7；流速：0.5 mL/min；进样量：50 μL；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm。

1.4.2 标准曲线的绘制 准确量取适量的标准储备液，用流动相分别稀释成25、50 、100 、200 、500 、1 000 ng/mL的标准工作液，供仪器分析，每个浓度重复检测两次，取其平均峰面积值为纵坐标，再分别以金霉素、多西环素和米诺环素的浓度为横坐标，绘制标准曲线，拟合，求标准曲线方程和相关系数。

1.4.3 样品的提取和净化 称取（5.00 ±0.05）g试样，置于50 mL塑料离心管中，加入0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH 4.0）15 mL，涡旋混匀1 min，用回旋振荡器振荡20 min后，15 ℃，6 000 r/min离心10 min，上清液转移到另一洁净50 mL塑料离心管中，在残渣中再加入0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液10 mL重复提取一次，涡旋混匀1 min，15 ℃，6 000 r/min离心10 min，合并两次上清液，涡旋混匀，6 000 r/min离心10 min，上清液转移至另一洁净50 mL塑料离心管，备用。

Oasis HLB固相萃取小柱依次用5 mL甲醇，5 mL水活化。取上述备用提取液10 mL过柱，调节流速小于1 mL/min，待样液完全流出后用5 mL水淋洗，挤干。用3 mL 0.01mol/L草酸-甲醇溶液洗脱，挤干，将收集的洗脱下来的溶液置于40 ～45 ℃水浴下氮气吹干，用流动相2 mL溶解残余物，涡旋混匀1 min后经0.45 μm滤膜过滤，滤液供高效液相色谱检测。

2 结果

2.1 线性关系

结果表明，在浓度为25～200 ng/mL的范围内，金霉素、多西环素和米诺环素的峰面积与其浓度呈良好的线性关系。

（1）CTC： y=1.09e+002x-6.36e+002 r=0.999 8；

（2）DC： y=1.66e+002x-9.69e+002 r=0.999 6；

（3）MINO： y=1.91e+002x-4.54e+002 r=0.999 9

2.2 方法的检测限和定量限

本方法在金霉素、多西环素及米诺环素的加标量为25 μg/kg时，经提取后测定，3种四环素类药物的信噪比S/N大于3；在加标量为50 μg/kg时，其信噪比S/N大于10，回收率均大于80.0%。故最终确定该方法的检测限为25 μg/kg，定量限为50 μg/kg，低于国家规定的四环素类抗生素的最高残留限量100 μg/kg。结果表明，该方法满足残留分析的要求，具有可行性。

2.3 方法的回收率、精密度及空白试验

确定检测方法后，分别以阴性的鳙鱼为空白样品，通过人为添加一定浓度的标准品，检测其方法的回收率。试验中分别在样品[每份（5.00±0.05） g]中添加0.250、0.500、1.000 μg的金霉素、多西环素和米诺环素进行回收试验，添加浓度分别相当于50 、100 、200 μg/kg，平行样共5份，同时考察了其日内精密度，其试验结果见表1、表2、表3。其日间精密度是采用100 μg/kg的加标浓量测定其回收率，每日测定一次，连续测定4 d，其结果见表4。

从表1、表2、表3可知，3种不同添加浓度的样品回收率在76.5%～89.1%，相对标准偏差均在10.0%以内。批内及批间变异系数均在10.00%以下。由表4可见，3种药物在100 μg/kg的加标浓度下，其回收率在79.9%～90.2%，相对标准偏差在10%以内。

空白试验：用阴性的鱼肉组织作为空白样品，按相同的方法进行试验，其测定结果表明，在与对照品中3种药物相应的保留时间里，空白样品对待测的目标药物无干扰。

3 分析

3.1 液相色谱分析条件的确定

3.1.1 色谱柱的选择 本试验先后试过几种不同品牌的色谱柱，结果表明，普通的C18色谱柱均可以将金霉素、多西环素和米诺环素较好地分离，只是在出峰时间、峰形以及峰面积上稍有不同，只要对流动相的成分比例做轻微的调整，均能使3种四环素类抗生素得到理想的分离。故本文最终选择了安捷伦Eclipse plus C18色谱柱。

3.1.2 检测波长的确定 四环素类药物的分子结构上带有两个发色团，在近可见光区有强烈的紫外吸收性质。经过对3种四环素类药物分别进行波长扫描并反复试用后，发现虽然270 nm波长处紫外有最大吸收，但检测基线干扰较大，峰型对称性较差，拖尾较严重，最终确定检测波长为350 nm。

3.1.3 流动相的选择

（1）流动相成分的选择。由于四环素类抗生素具有酸碱两种性质，且其在碱性环境中会处于一种不稳定的状态，在中性环境下又会和多种金属离子产生螯合物。而这种金属螯合物对反相色谱柱有吸附的作用，影响峰形的对称性，产生拖尾峰，所以一般常在其流动相中加入如EDTA、磷酸和草酸等有机酸[1]。

对其峰形和分离度进行综合考虑，以乙腈∶甲醇∶0.01 mol/L草酸溶液为流动相时，样品基质的杂质干扰峰较小，响应值较高，无明显拖尾现象。

（2）流动相pH对试验的影响。流动相的pH对试验有很大的影响。试验发现，0.01 mol/L的草酸溶液pH约为2.0时，对CTC、DC、MINO 3种药物的分离度均为3.0以上，较为理想，但是米诺环素的出峰时间较早，约为4.0 min左右，容易与样品基质中的杂质干扰峰混在一起，影响其定量检测的准确性。当pH大于3.5时，金霉素和多西环素的保留时间很接近，分离度达不到要求，且同时3种药物峰形也受到很大的影响，理论塔板数迅速下降，且出现严重拖尾现象，金霉素和多西环素的响应很低，影响了其检测的灵敏度。

经反复试验，发现当草酸水溶液的pH为2.5时，3种目标药物峰能和杂质峰很好地分离，保留时间适中，峰形较好，且无明显拖尾现象。

（3） 流动相配比对试验的影响。米诺环素因容量因子最小，出峰时间最早，容易与样品基质中的杂质干扰峰重叠，对其定量检测造成影响；但是有机相的比例太低又会引起出峰时间太晚，产生拖尾，降低检测灵敏度，而多西环素的容量因子是待测的3种药物中最大的，出峰时间最晚，拖尾最为严重[2]。试验采用了3种不同的比例∶乙腈∶甲醇∶0.01mol/L草酸溶液分别为=4∶2∶4； 2∶1∶8； 2∶1∶7，经过反复对比，发现最后一种比例对3种物质的分离度、峰形、灵敏度和保留时间等最为合适。

3.2 样品前处理方法的确定

3.2.1 提取溶剂的选择 在生物组织中，四环素类药物极易与蛋白质结合，需使用酸性溶液使其脱蛋白，从中提取待测的四环素类抗生素。但是酸性太强（pH<2.0）会导致四环素类抗生素降解生成脱水产物，且加热时会转变成差向异构体。所以提取液必须选用弱酸性溶液[2-5]。在本试验中分别用0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH4.0）、Mcllvaine缓冲液、5%高氯酸、5%三氯乙酸4种不同的提取液对添加了1 μg/g药物的鱼肉组织进行提取（依次使用15mL、10mL提取），测定3种药物的平均回收率。结果表明，0.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH4.0）的综合提取效率最好。

3.2.2 样品的净化

（1）固相萃取小柱的选择。Oasis HLB固相萃取小柱是一种亲水亲脂平衡的水可清润性反向吸附型萃取柱，对极性化合物有良好的保留能力，其可耐受广泛的pH范围和溶剂，保留药物的容量也比一般的传统硅胶基质填充的萃取小柱要高3倍。

四环素类药物的净化一般采用Oasis HLB柱和C18固相萃取小柱。为了比较哪种萃取小柱对四环素类药物的回收率最好，做了一个试验性实验。处理添加待测药物的样品（添加量100 ng/g），使其同时过Waters Oasis HLB（60 mg，3 mL）和Agilent C18（500 mg，3 mL）两种萃取小柱，比较其回收率及净化效果。结果表明，Waters Oasis HLB柱效果较好，回收率高，杂质干扰少。

（2）淋洗液的选择。在样品溶液全部过柱后，除了金霉素、多西环素、米诺环素3种目标待测物附着在HLB萃取柱的吸附床上外，还有一些化学结构和极性相似的杂质和其他抗生素可能也附着在上面，所以需要用淋洗液进行淋洗，用于去除小柱吸附床上的大部分杂质，对样品进一步净化，本文中分别用5 mL的水、2%甲醇/水、5%甲醇/水、8%甲醇/水进行淋洗后，将淋洗液收集，检测其金霉素、多西环素及米诺环素的含量。结果发现，除了用8%甲醇/水作为淋洗液的洗涤液中含少量的待测物质外，其他的洗涤液中均检测不出目标物质。由于前3种淋洗液的效果差不多，为了使操作简便化，最终采用5 mL水作为淋洗液。

（3）洗脱液的选择。反向萃取柱一般使用甲醇、乙酸乙酯、正己烷、异丙醇等有机溶剂作为洗脱液。根据四环素类药物的性质，按照理论，甲醇、0.01 mol/L草酸甲醇和流动相均可以将其洗脱下来。有资料显示为了克服四环素类抗生素不稳定以及易与共萃物难分开等问题，可在淋洗液中加入草酸以提高其回收率和改善净化结果。试验中将添加浓度为100 ng/g的样品处理后，过Oasis HLB萃取小柱，用甲醇、0.01 mol/L草酸甲醇溶液和流动相分别作为洗脱液处理样品，洗脱液体积为3 mL，前两种洗脱后，在40～45 ℃水浴下氮气吹干，用流动相2 mL溶解残余物，过滤后检测；后一种洗脱后直接过滤检测。结果表明，采用0.01 mol/L草酸甲醇溶液作为洗脱液回收率高，杂质干扰较少，效果最优。

4 小结与讨论

本研究通过反复试验建立了检测鱼肉中金霉素、多西环素、米诺环素的多残留量的高效液相色谱法，确定了高效液相色谱检测条件：色谱柱为安捷伦Eclipse plus C18柱，250 mm×4.6 mm，粒径5 μm，或相当者；流动相为乙腈∶甲醇∶0.01 mol/L草酸溶液（用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至2.5）=2∶1∶7，等梯度洗脱；流速为0.5 mL/min；检测波长为350 nm；进样量为50 μL；柱温为25 ℃。

方法中对样品的提取净化过程进行了优化，采用0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH 4.0）提取样品中的待测药物，用Oasis HLB固相萃取小柱净化，其操作简单，杂质较少，提取效果好，回收效率高。

结果显示3种目标药物的线性范围为25～200 ng/m L。通过加标样品的测定结果，确定了该方法中金霉素、多西环素、米诺环素的检测限为25 μg/kg，定量限为50 μg/kg。其回收率在76.5%～89.1%，批内及批间变异系数均小于10.00%。

该检测方法较现有的检测四环素类药物的方法创新之处在于：使用等梯度洗脱检测鱼肉组织中米诺环素、金霉素和多西环素的多残留检测；将流动相中的0.0 1mol/L的草酸溶液的pH调至2.5；使用0.01 mol/L草酸甲醇作为洗脱液，氮气吹干后使用流动相复溶。结果表明，此方法能达到较好的回收效果，证实了其适用性。

试验中检测的是鱼肉组织，今后在相关试验中还可以尝试选用其他可食性动物组织进行检测，扩宽其适用范围。本文中检测的只有3种四环素类抗生素，在今后的研究中可尝试通过调整高效液相色谱条件和改进样品处理方法来检测更多种类的四环素类药物。

参考文献：

[1] 李俊锁，邱月明，王超等.兽药残留分析[M].上海：上海科学技术出版社，2002.365-391.

[2] 黄志勇，蔡洪基，黄高凌.等.水产品中四环素类抗生素残留的高效液相色谱测定方法[J].福建分析测试，2005，14（1）：2093-2105.

[3] GB/T 20764-2006可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量测定-高效液相色谱法[S].2007-03-26.

[4] 张纯萍，刘艳华，门立强.等.牛奶中四环素类药物残留的确证方法-液质联用法[J].中国兽医学报，2005，25（6）：649-650.

[5] 岳振峰，郑卫平，谢丽琪.等.高效液相色谱法测定动物组织中四环素类抗生素残留量的研究[J].分析试验室，2006，25（10）：24-28.