以同源异形盒家族HOXC6基因为靶标荧光PCR鉴定地沟油的方法研究

杨冬燕 杨永存 李浩 耿艺介 张倩 吴双 邓平建

【摘 要】目的：以动物源性的同源异形盒家族HOXC6基因为靶标建立地沟油鉴定方法。方法：通过基因数据库的筛查、比对及特异性验证，筛选确定以动物源性的同源异形盒家族HOXC6基因为靶标，采用实时荧光PCR方法对正常植物油和地沟油进行鉴定。 结果：6个已知来源的地沟油样品全部被鉴定为地沟油，而8个正常食用植物油全部被鉴定为非地沟油。 结论：与课题组前期建立的采用针对多个动物物种特异性基因的PCR鉴定方法相比，该研究建立的方法在有效提高检测灵敏度的同时，不但避免了先后扩增多个基因片段的繁琐，同时降低了PCR污染的风险，提高了检测结果的准确性。

【关键词】地沟油；同源异形盒家族；HOXC6基因；荧光PCR

地沟油也称泔水油或潲水油，是不法商贩将收集来的潲水，经过水油分离、过滤、去味等程序处理后，重新得到的油脂。由于潲水中常常会混有污水、洗涤剂和其他各种杂质，运输和储存过程也不会考虑任何卫生要求，极易发酵变馊。加之地下作坊提炼过程纯粹是以

“卖相”为目标，根本无法除去细菌和有害化学成分，人食用后易引发头昏、头痛、恶心、呕吐、腹部疼痛以及肠胃道疾病[1-2]。公众强烈呼吁严厉打击地沟油制售，有效遏制地沟油回流餐桌。

自2011年10月起，经过全国范围的征集、专家论证及盲样考核， 初步确定7个地沟油检测方法进行验证完善，但到目前为止尚未明确这些地沟油检测方法的最终验证结果。课题组前期采用PCR技术，研究建立以鸡、牛、猪、羊等各动物物种特异性基因为靶标的地沟油鉴定方法，经大量试验验证及专家评估表明，该方法与其他以差异性指标为靶标的检测方法相比，其检测指标的高度特异性具有显著优势，由于动物源性基因是只存在于地沟油，不存在于正常食用植物油的特异性标志物，只要从植物油样中检出动物源性基因，不论其含量多寡，都可以判定该油样为地沟油[3]。但前期方法的主要不足在于方法的灵敏度不足，且采用PCR技术扩增多个基因片段，实验步骤繁琐，容易污染从而出现假阳性。

本研究在前期研究基础上，采用灵敏度更高的荧光PCR技术，以动物源性的同源异形盒家族HOXC6基因为靶标建立地沟油鉴定方法。该方法在有效提高检测灵敏度的同时，不但避免了先后扩增多个基因片段的繁琐，同时降低了PCR污染的风险，提高检测结果的准确性。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器

荧光PCR扩增采用TAKARA荧光PCR扩增试剂盒（货号DRR390）；引物、探针由大连宝生物技术公司合成。核酸蛋白分析仪（Eppendorf 6131）购自德国，ABI7500 荧光PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 样品

1.2.1 地沟油样品 DG01， DG02号地沟油样来自食品监督部门没收，DG03～DG04地沟油样由深圳市滕浪再生资源发展有限公司提供，DG05～DG06号是按照油脂精炼工艺精炼的地沟油样品。

1.2.2 食用植物油样品 样品编号ZC01-ZC08， 分别为金龙鱼第二代食用调和油、鸿禧牌压榨一级花生油、刀唛橄榄芥花籽油、金浩茶籽花生食用调和油、刀唛玉米亚麻籽油、润之家一级大豆油、福临门一级大豆油、刀唛葵花籽油，均购自深圳市万佳超市。

1.2.3 动物与植物样品 选取7种动物和11种植物组织样品验证选取的靶标基因的物种特异性，动物物种包括牛、羊、猪、马、鸡、鸭、鱼；植物样品包括芝麻、葵花籽、油菜籽、花生、油棕、棉籽、玉米、大豆、小麦、大米、辣椒。

1.2.4质控样品：PCR扩增阳性对照样品为源自猪肉的核酸提取物；以去离子灭菌水作为PCR空白对照。

1.3. 核酸提取

1.3.1 地沟油核酸提取：地沟油核酸提取采用课题组之前建立的精炼食用植物油DNA提取方法[3-4]。

1.3.2 食用植物油核酸提取：方法同1.3.1地沟油核酸提取。

1.3.3 验证样品核酸提取：

1.3.3.1 动物组织基因组DNA的错误！链接无效。 采用网络检索到的方法[5]，略加改动， 将样品量及所有试剂用量减少到1/10。

1.3.3.2 植物组织基因DNA的错误！链接无效。 植物组织经磨机磨成粉末后取100mg，利用Qiagen Mini Plant DNA extraction kit 试剂盒，按照试剂盒操作说明错误！链接无效。基因组DNA。

1. 4样品核酸提取效果评估 对上述各种样品按相应的方法提取核酸后，采用核酸蛋白分析仪测定核酸提取液的DNA含量，从而确定核酸提取效果。

1.5靶标基因的筛选与确定 根据课题需要查阅了大量文献，统计出了人、大鼠、小鼠中共有的基因条目约500条，之后，以这500条基因序列信息为对象，在深圳华大基因公司的千种植物基因组数据库中做比对，筛选出一批植物中没有的基因；其后，将筛选出的基因在NCBI数据库中做BLAST比对，最终确定在国人饮食涉及的常见动物中的普遍存在的靶标基因——同源异形盒家族HOXC6基因，根据基因序列设计引物和探针，引物探针由大连宝生物公司合成。

1.6 荧光PCR检测 扩增反应体系参照试剂盒说明，在20μL荧光PCR扩增体系中，引物浓度0.4μmol/L， 模板含量为40pg扩增。荧光PCR扩增条件：95℃预变性30s、95℃变性5s、60℃退火与延伸30s，40 个循环。每个样品进行一次平行测定。

2 结果

2.1 样品核酸提取结果

对上述各种样品按相应的方法提取核酸后，采用核酸蛋白分析仪测定核酸提取液的DNA含量，结果表明动物组织核酸提取得率最高，核酸提取液的DNA浓度高达100-140?g/ml， 植物样品核酸提取液的DNA浓度在50-65?g/ml， 食用植物油和地沟油由于在精炼加工过程中对核酸的破坏和降解，导致核酸提取液中DNA浓度较低，只有6-13?g/ml， 但该浓度尚能满足荧光PCR扩增的需要。

2.2 靶标基因及目标扩增片段的筛选结果

按照上述筛选方法，通过与深圳华大基因公司的千种植物基因组数据库比对，本研究确定HOXC6基因（Genbank NW 153693）639-904bp之间的片段与千种植物基因不相匹配，并根据此段基因采用Primer 5软件 设计引物和探针，最终确定上游引物为5-CTCGACTCCCTTTTATTC-3，下游引物为5-CTGTGTGTTATGTCCTAAG -3，探针5 AATGTCGTGTTCAGTTCCAGCC 3，报告基团FAM490，淬灭基团Eclipse，扩增142bp的目标片段，如图1所示。

图1 HOXC6基因639-904bp段及目标扩增片段

2.3 目标扩增片段特异性验证

本研究选取牛、羊、猪、马、鸡、鸭、鱼7种动物的肌肉组织和芝麻、葵花籽、油菜籽、花生、油棕、棉籽、玉米、大豆、小麦、大米、辣椒11种植物组织，提取基因组DNA，荧光PCR扩增HOXC6基因目标片段。扩增结果显示哺乳动物样品Ct值小于21，鸡、鸭、鱼等非哺乳动物扩增阴性或Ct值较大；而11种植物组织的HOXC6基因目标片段的扩增结果全部为阴性（见表1），实时扩增曲线见图2和图3。

2.4 地沟油和食用植物油鉴定结果

针对DG01-DG06号地沟油样品和ZC01-ZC08食用植物油样品的HOXC6基因目标片段扩增结果显示6个地沟油样品全部检出目标核酸片段，而正常植物油样品扩增结果全部为阴性（见表2），实时扩增曲线见图4和图5。

3 讨论

同源异型盒基因（homeobox genes，Hox）是动物同源异形基因中的保守基因片段，是调控动物个体的体节、椎骨位置及其形态和数量的基因。其在胚胎发育中的表达水平对于组织和器官的形成具有重要的调控作用，该类基因的突变会在胚胎发育过程中导致某一器官异位生长。哺乳动物具有四个相似的HOX基因簇，分别是HOXA、HOXB、HOXC和HOXD，它们位于不同的染色体上，由9到11个基因串联而成[6，7]。HOXC基因位于人12号染色体，HOXC6是其中一个子类基因。哺乳动物的HOXC4、HOXC5 和HOXC6共用一段非编码外显子，对于每一个基因来说，其转录子可能包括这段共用序列和它特异的外显子序列，也可能只包括特异的外显子序列。本研究针对哺乳动物组织的HOXC6基因扩增结果全部为强阳性，其Ct值均小于21，对鸡、鸭、鱼3种非哺乳动物的扩增结果显示鸭肉组织扩增阴性，鸡肉组织扩增Ct值为22.37，鱼肉组织扩增Ct值为31.68，结果提示本研究选定的HOXC6基因扩增片段在哺乳动物中具有严格的保守性，但HOXC6基因不是哺乳动物特异性的序列，与其他非哺乳动物存在一定的交叉。而该基因片段与千种植物基因比对未检出同源序列，且本研究针对11种植物组织的扩增结果全部为阴性，因此，HOXC6基因的动物特异性属性完全满足地沟油检测的需要。

本研究通过HOXC6基因扩增方法对3个不同来源的6个已知地沟油样品进行鉴定检测，结果显示6个样品检测结果全部为阳性，由于6个地沟油样品精炼程度不同，其扩增Ct值也有一定差异，DG03和DG04号油样精炼程度最低，扩增Ct值最小，提示其内目标核酸片段浓度最高，而随着精炼程度的提高，地沟油中核酸残留渐少，对扩增灵敏度要求更高。该研究所用的6个样品，同时采用课题组前期建立的以鸡、牛、猪、羊等各动物物种特异性基因为靶标的普通PCR鉴定方法进行鉴定，结果显示5个检出地沟油阳性，其中DG05号样品为阴性，而该样品采用本研究检测结果Ct值最大，提示采用实时荧光PCR方法以HOXC6基因为靶标鉴定地沟油，其检测灵敏度略高于普通PCR方法，且只需扩增一个靶标片段，方法更简便，结果更可靠。

致谢：

本研究在靶标基因筛选及与植物基因数据库比对工作中获得深圳华大基因公司的大力支持，特此致谢。

参考文献：

[1] 尹平河. 薄层色谱法快速鉴别潲水油和煎炸老油的研究[J]. 中国油脂， 2004， 29（4）： 47-49.

[2] 黄道平， 彭进， 谢燕湘，等. 潲水油鉴别检测方法研究[J]. 中国卫生检验杂志， 2006，16 （2）：151-153.

[3] 杨冬燕， 杨小柯， 杨永存，等. 潲水油聚合酶链式反应鉴定技术研究[J]. 中国食品卫生杂志，2011， 23（3）：255-260.

[4] 杨冬燕，邓汉超，杨永存，等. 精炼食用植物油PCR检测技术研究[J]. 中国卫生检验杂志，2010，20（4）：700-702.

[5] 从动物组织提取基因组DNA，2010.9.4. http：//www.51protocol.com/AandP/dongwushiyanjishu/20071219/50794.html.

[6 ] 哈斯图雅，赖双英，乌达巴拉，等.同源异形盒基因的研究现状[J].畜牧与饲料科学，2009，30（2）：141-142.

[7] 任德全，刘玉芬，许丽敏，等. 同源异型盒基因研究[J].安徽农业科学，2011，39（4）： 1949-1950.

作者简介：

杨冬燕（1972-），女，硕士，主任技师，主要从事食品卫生检验和研究工作

通讯作者：

邓平建，男，主任技师

基金项目：

1. 深圳市科技计划重点项目 深卫人医政【2012】251号；2. 深圳市技术研究开发计划技术攻 关项目（深发改【2012】866号）