HIV感染窗口期及其检测技术进展

【摘 要】获得性免疫缺陷综合征即艾滋病在全世界流行现状十分严峻，无有效的治疗方法、无有效预防疫苗，健康教育和行为干预是遏制艾滋病流行的最有效手段，因此应早发现艾滋病病毒（HIV）感染者并采取措施控制其流行。在HIV感染窗口期体内已有艾滋病病毒，处于窗口期的感染者同病人一样具有传染性，所以缩短窗口期时间尽早检测出HIV，对控制艾滋病流行有重要意义。本文综述了实验室在HIV窗口期按照检测的标志物分为：HIV抗体、HIV-1P24抗原、HIV核酸、细胞培养等检验方法。

【关键词】HIV；艾滋病；窗口期；检测技术

获得性免疫缺陷综合征即艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染所引起的一种严重的传染性疾病，主要经性传播、血液及母婴传播，具有传播迅速、发病缓慢、病死率高的特点。自1985我国检测出首例艾滋病病人以来，HIV感染人数逐年增加，AIDS在高危人群中呈明显的上升趋势[1]。在HIV感染后，最先检测到病毒的RNA，然后是P24抗原，最后是抗体。人体感染了HIV后，一般需要2周时间才能逐渐产生病毒抗体。“窗口期”本质是病毒感染后在体内复制定植和机体反应的过程：从无到有、由少到多，即HIV感染到抗体检测阳性的这段时间，一般为2周～12周。在此期间，虽然血液中检测不到病毒抗体，但是同样具有传染性。缩短窗口期，及早发现感染者，对于控制HIV流行有重要的作用。随着检测技术的不断进展，HIV感染窗口期逐渐缩短。

1 抗体检测

窗口期包含有两方面含义：一是机体还没有真正对HIV产生特异性的体液免疫而产生HIV抗体，微生物感染机体后1周左右最先产生IgM抗体，随后出

现IgG抗体；二是抗体已产生，但是还未达到检测方法的最低检出限值，也归为窗口期。

ELISA法

ELISA法是临床上应用最广泛的检测技术，至今仍在血液筛查中普遍应用。它具有特异性强、灵敏度高、操作简便、结果判断指标客观、结果便于纪录和保存等优点，既可用于单个样本的测定，也适合大批标本检测。其检测试剂现已发展到第4代。

1.1.1 1985年美国生产了第1个HIV抗体检测试剂并应用于临床献血员的筛查，此即为第1代HIV诊断试剂。该试剂用HIV全病毒裂解物为包被抗原，采用间接酶联免疫法检测HIV IgG抗体，检测的窗口期大约为10周[2]。该试剂由于包被的抗原来自宿主细胞因而易发生假阳性反应，并且所检测的血清需要高度稀释，敏感性和特异性较低。尽管如此，第1代HIV检测试剂的出现仍然具有重要的意义。

1.1.2 随着基因工程技术迅速发展，1990年5月第二代使用基因重组或合成多肽抗原的HIV诊断试剂盒面试。虽然仍然是利用间接酶联免疫法检测，但该试剂使用重组或合成的抗原多肽为包被抗原检测血液中的HIV IgG抗体，保证敏感性的同时特异性也有了很大提高，可以将窗口期缩短至33～35 d[3]。同时由于第一代试剂盒只含有HIV-1抗原，而HIV-1抗原与HIV-2抗原的核苷酸序列相差40%，因此检测HIV-1抗体的试剂盒对HIV-2抗体阳性的标本灵敏度较低，常发生漏检，针对此种情况第二代诊断试剂盒中出现了HIV-1/HIV-2抗体诊断试剂盒盒，这种试剂盒盒在包被的抗原中又加入了HIV-2抗原（gp36多肽），使得在一次试验中可同时检测HIV-1和HIV-2抗体，既节约了时间和人力，又节约了成本。第二代试剂盒与第一代相比，特异性有明显的提高。

1.1.3 1994年美国研究出了第3代HIV检测试剂。它改变了过去间接酶联免疫法的检测原理，利用双抗原夹心法检测标本中的抗体，同时酶标记物也由过去的IgG抗体改为HIV特异抗原，进一步提高了敏感性。此外，由于在非洲发现了HIV-1O群，而用HIV-1/HIV-2试剂检测时常出现假阴性，因此在第3代试剂中又加入了HIV-1O群的抗原。第3代试剂可以同时检测出HIV IgG、IgM、IgA等不同抗体亚型，同时不需将标本过度稀释来保证反应的特异性，具有较高的敏感性，窗口期也由35d缩短至22d[2]，因而成为国际上的主流检测试剂。目前，我国国产第3代HIV诊断试剂盒在敏感性、特异性方面已达到国际先进水平[4]。

1.1.4 1998年，国际上研制出了第4代HIV检测试剂。这种试剂将针对p24抗原的抗体与HIV-1/HIV-2型抗原一起包被于固相载体，并不影响HIV抗体的检测，进一步缩短了窗口期，其敏感性也较第3代试剂有所提高。在对第四代试剂盒的研究中发现p24抗原滴度降低与血清阳转过程中未降低S/CO值，也没有发现第四代试剂盒检测阴性而第三代试剂盒检测为阳性的样本，所以未在p24抗原血症和血清抗体阳性转之间引入诊断的第2个窗口期。第四代由于可同时检测艾滋抗原和抗体，未完善的HIV感染的筛查试剂盒，而且酶联免疫法检测HIV p24抗原操作简便，成本低廉，可以在普通实验室得到普及[5]。基于这一特点，在不久的将来，第4代试剂取代第3代试剂，成为高危人群血液筛查，提高输血安全性的主要检测试剂[6]。

许文燕等[7]的研究表明，与第3代试剂相比，第4代试剂可将检测窗口期平均提前4～8d，但与单独的抗原检测试剂盒相比要滞后2～4d。张麒等[8]也通过评估第4代试剂对静脉吸毒者感染窗口期的检测能力得出结论：第4代试剂临床检测特异性为99.2%，假阳性率为0.8%。朱绍汶等[9]用第3代和第4代检测试剂检测了69650例无偿献血者样本，发现第4代检测试剂在无偿献血人群中检出HIV感染者的敏感性为100%，特异性达了到99.93%。Malm等[10]分别用3种不同的第4代试剂检测了40000份血清样本，发现其检测特异性均超过了99%。Pandori等[11]研究发现第4代试剂对急性期和近期HIV感染的检出率达到了89%，对于抗体阴性，HIV RNA阳性者的检出率也达了到80%。

Speers等[12]针对第4代试剂提出了“第2窗口期”的概念，其原因是p24抗原于感染后2～3周即可检出，然后随着抗体的产生，p24抗原浓度开始下降，在这段时间内既检测不到p24抗原也检测不到抗体，称为“第2窗口期”。尽管这种情况很少见，但也提示应注意“第2窗口期”的存在。

2抗原检测

在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化2～18天被检测到[13]，因此，通过检测P24抗原可以作为早期诊断HIV感染的一种方法。p24抗原一般采用ELISA双抗体夹心法检测。 HIV-1p24抗原检测的灵敏度为30%～90%，该结果仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊检测结果阴性只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染，临床上一般不作为常规诊断项目[14]。

为了提高检测血清中p24抗原的敏感性，研究者将血清中免疫复合物解离后再进行测定，发展了免疫复合物裂解法（ICD）p24抗原测定法。该法是用加热或酸、碱处理的方法使抗原抗体复合物分离，从而增加p24抗原的浓度，提高检出率[15]。Sutthent等[16]将免疫复合物热解离后，通过酪胺信号放大系统（TSA）使用ELISA法进行检测，使p24抗原的最小检出值由原来的10pg/ml降低0.5pg/ml。在HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的鉴别诊断中与RNA检测相当，与HIV核酸检测具有可比性，具有重要的实用价值。Workman等[17]采用超顺磁性颗粒为标志物，用磁珠免疫层析的方法检测HIV-1p24抗原，可在40 min内完成。此方法易操作，为HIV-1 p24抗原检测提供了一种方便、低成本的快速检测方法。

3 核酸检测

随着生物技术的发展，核酸检测得到了人们越来越多的重视，它可直接检查HIV RNA，可在发现血清学变化之前检测HIV感染，而且比P24抗原检测方法更灵敏。简单的说就是病毒感染人体后，一般情况下可通过一系列检测被发现，而最早能被检测到的是病毒核酸。现有的酶联免疫等血清学检测方法检测的是抗原或抗体，而核酸检测技术检测的是病毒核酸，所以能更早地发现病毒感染。HIV核酸检测是检测病毒的RNA，通常用血浆HIV-RNA的拷贝数来表示病毒复制的数量，即病毒载量。常用的病毒载量检测方法有 逆 转 录PCR法（RT-PCR）、核酸序列扩增试验（NASBA）和分支DNA扩增试验（BDNA）等。3种方法的原理不尽相同，前两者属于靶扩增，后者属于信号扩增。逆转录PCR靠高温变性-低温退火-中温延伸的反复循环完成核酸的指数扩增，而NSBA是在等温条件下的核酸扩增技术。

近几年随着分子生物学的发展而发展起来的荧光实时定量PCR检测技术使HIV核酸检测进入到一个新境界。这种方法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术改变了传统的终点检测，实现了PCR从半定量到定量的飞跃。2002年4月我国已经批准生产了第一个HIV荧光PCR检测试剂盒。

4 病毒培养

病毒培养是检测HIV感染最精确方法。一般采取培养外周血单个核细胞（PBMC）的方法，进行HIV诊断[18]。细胞培养的方法检测HIV[19-20]专一性强，不会出现假阳性，对于确认那些抗原/抗体检测不确定的个体和阳性母亲新生儿是否感染HIV有着重要意义。但是病毒培养的方法必须要有一定数量的感染细胞存在才能培养和分离出病毒来[21]，因而敏感性差、操作时间长、操作复杂，必须在特定的P3实验室中才能进行，并且费用昂贵，因此极少用于窗口期的检测。

HIV感染者处于窗口期时，通常不能检测到患者体内抗体，而患者体内由于大量病毒存在传染性极强，因此如何在提高检测灵敏度、特异性，缩短窗口期及早发现感染者的同时，达到检测快速、操作自动化和降低成本的目的，将是HIV临床检测技术的未来研究方向。 随着科技进步，相信不久的将来，高灵敏、高特异、低成本的HIV检测技术将会诞生。

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作者简介：

叶瑞国（1978-），男，大学本科学历，主管技师，现主要从事微生物检验及管理工作。