不同刺激因素对小鼠胶原的影响

2013-04-29 00:44吴振宇吴广均姜泉等
风湿病与关节炎 2013年8期
关键词:心理应激辐射损伤实验研究

吴振宇 吴广均 姜泉等

【摘 要】目的:探讨辐射刺激、心理应激加酒精刺激及抗原免疫刺激3种不同因素对胶原蛋白的代谢失调及组织器官的损坏。方法:辐射刺激采用γ射线照射,心理应激加酒精刺激采用小站台水环境应激加质量浓度42%白酒灌胃刺激,抗原免疫刺激采用II型胶原免疫。胶原蛋白采用苦味酸-天狼星红染色,偏振光显微镜下观察;Image-Pro Plus图像分析系统胶原变化状况。结果:辐射损伤后胶原在血管周围的面积明显较非刺激组增多,辐射后4周较2周更严重;心理应激加质量浓度42%白酒灌胃后,心、肝、肾的血管周围均出现胶原沉聚面积加大,且向周围组织渗透;II型胶原免疫后关节腔胶原的沉聚面积较非刺激组更为严重,导致关节强直。结论:物理、化学、心理及生物因素都会不同程度影响胶原蛋白的代谢与失衡,这些胶原蛋白沉聚在血管周围导致硬化,反应的面积大小次序为心>肾>肺>肝。沉聚在关节周围导致关节强直或活动受限。

【关键词】 胶原蛋白;辐射损伤;心理应激;酒精肝损伤;小鼠;实验研究

胶原蛋白是生物体内一种重要的蛋白质,也是结缔组织的主要蛋白成分,由于其优良的理化性质和生理活性功能,已引起人们的广泛关注。水解动物蛋白又称酶解胶原蛋白,是一种生物性高分子物质,其含有的18种氨基酸中有7种是人体必需的,还含有人体所必需的部分金属微量元素,蛋白营养价值高、性能优越,是良好的天然生理活性物质,易被人体吸收利用,故能促进细胞生长,改善人体多种功能,免疫调节作用明显。骨胶原多肽具有抗高血压、抗氧化和衰老、预防和治疗骨关节炎和骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病和促进皮肤胶原代谢、促进矿物质吸收等生理功能[1-3]。

但是事物都有其两面性,在自然界和日常生活中,可怕的物理、化学、心理和生物的致病因素会给胶原带来不同的“新生”,胶原的作用可谓喜忧参半。辐射损伤、心理应激及酒精肝损伤及免疫性关节炎实验提示,胶原参与了疾病的发生发展过程,现将研究结果报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 7~8周龄昆明小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号0205315)70只,雌性,体质量20~22 g。

1.2 实验试剂 天青石蓝、饱和苦味酸天狼星红(Sigma公司生产)、质量浓度42%白酒。

1.3 实验仪器 60Coγ照射机(北京双原仪器有限公司生产);有机塑料盒;电刺激条件反射箱及水站台实验设备(自制);均质仪(Ika)、日本生产的OLYMPUS IX-70倒置荧光显微镜及Image-Pro Plus图像分析系统。

2 方 法

2.1 动物分组 ①按物理因素刺激分为未照射组、照射组;②按心理及酒精因素刺激分为未应激组、心理应激组、心理应激+酒精刺激组。③按生物因素刺激分为未刺激组、胶原免疫刺激组。按以上3种因素将实验用小鼠共分为7组,每组10只。正常饲养。

2.2 物理因素刺激(放射照射刺激) 照射动物采用60Coγ射线进行全肺单次照射24Gy。2周和4周取肺病理切片。

2.3 心理及酒精因素刺激(应激+酒精刺激) 电刺激条件反射箱,实验时通电,放入小鼠,电击其足底部;每日定时电击1次,每次20 min。电击后,水环境站台18 h,即7:00-23:00,中间每隔3 h给予食物灌胃1次,每天22:00给予酒精诱导,持续10 d。取心、肝、肾病理切片。

2.4 生物因素刺激(II型胶原免疫刺激) 取0.05 mL

乙酸加入Ⅱ型胶原冻干粉中,使其混合均匀,将完全佐剂置入试管中,开启均质仪慢慢加入等量Ⅱ型胶原,乳化至油包水状。在每只小鼠尾根注射Ⅱ型胶原和完全佐剂乳化后的混合液0.1 mL,1周后以相同剂量予每只大鼠尾部加强注射1次,取关节病理切片。

2.5 苦味酸-天狼星红染色 组织病理切片用质量浓度0.1%饱和苦味酸天狼星红溶液染色60 min,

自来水洗5 min。May-苏木素染液复染细胞核1 min,

自来水洗10 min,梯度酒精脱水各1 min,二甲苯透明各15 min,中性树胶封片。偏振光显微镜下观察肺泡间隔及肺间质面内胶原的沉聚分布。

用日本产OLYMPUS IX-70倒置荧光显微镜及Image-Pro Plus图像分析系统,在偏光显微镜下分别测定胶原在血管周围的面积变化。

2.6 统计学方法 采用SPSS15.0软件进行统计分析,计量资料以表示,组间差异采用方差分析及t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 2 400cGy 60Coγ射线对小鼠肺小血管胶原的影响 当多次辐射损伤后,胶原的代谢失衡,肺血管周围明显增多,面积加大,4周后有胶原向肺组织渗透,这是放射损伤的前期血管变化之一,最终导致肺纤维化,见表1、图1。

3.2 心理应激及酒精刺激对小鼠心、肝、肾血管的影响 心理应激及心理应激加酒精刺激后,心、肝、肾血管均出现胶原的增多,特别是向血管周围的扩展及胶原种类的增多,是导致这些组织和器官硬化的主要因素,见表2、图2-4。

3.3 Ⅱ型胶原和完全佐剂对小鼠关节胶原的影响 免疫刺激后的关节变化表明,胶原大量产生和代谢失衡,大量的胶原沉聚在关节腔,导致关节强直和结构破坏,见图5。

4 讨 论

胶原蛋白是机体内含量最多的蛋白质,约占到人体总质量的6%。它们存在于细胞与细胞之间,扮演着连接组织的角色[1]。胶原蛋白分布在全身各个组织器官之中,如骨骼、软骨、韧带、各种内膜、筋膜及相关组织等, 为机体维持各个器官的形态、结构和张力。胶原蛋白是一类特殊的蛋白质,一般的蛋白质是双螺旋结构,而胶原是一种三螺旋结构的特殊硬蛋白。过去认为胶原是无生理活性的蛋白质,随着对其深入研究后发现,胶原与组织的形成、成熟,细胞间信息的传递,细胞的增生、分化、运动,细胞免疫,肿瘤转移以及关节润滑,伤口愈合、钙化作用,血液凝固和衰老等有着密切的关系;也与许多结缔组织胶原病的发生密切相关。

4.1 胶原蛋白与血管 器官纤维化是导致器官衰竭的常见原因之一,在发达国家,大约有45%的患者死亡与慢性纤维增生性疾病有关。在我国,肺纤维化的发病率近年有上升趋势。肺纤维化与肺泡毛细血管基底膜受损、上皮内皮细胞再生障碍及肺组织的异常修复有关,它以过度的细胞外基质沉聚和抗凋亡的肌成纤维细胞聚集为特征。细胞外基质过度沉聚是肺纤维化的重要特征,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白是肺纤维化细胞外基质(ECM)的主要成分,它们在肺组织中的含量反映了肺纤维化的严重程度。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类最重要的降解ECM的蛋白酶家族,并且MMPs中的某些成员是至今为止发现的唯一能分解纤维性胶原的蛋白酶,如Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白即主要由MMP-1分解代谢,其作用受金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPS)如TIMP1的调节,两者均为TGF-β/Smads的下游细胞因子。

目前已确认的胶原蛋白有近30种之多,以I、Ⅱ及Ⅲ型最为常见,其中I型胶原占全部胶原蛋白的90%以上,是生物体各种结缔组织(脑膜、筋膜、韧带等)的主要组成分。图1~5显示,物理、化学、生物及心理的因素均可以导致血管周围胶原代谢的异常,所以,如何避免物理、化学、生物等不利因素及调整心理应激因素是防治疾病的关键,50%以上疾病的发生和发展都与胶原的合成-分解异常相关,如何保持胶原代谢的平衡是研究者的重要课题。

4.2 胶原蛋白与骨 胶原约占人骨中有机成分的90%~95%,主要是以I型胶原为主。近期临床观察发现,细胞表面的特异性受体α整合素亚单位紧密结合后,可促进成骨细胞的黏附、增殖、分化。研究发现,I型胶原可提高成骨细胞的成骨能力,刺激骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。

关节软骨主要由软骨细胞和胞外基质组成。正常关节软骨基质内的主要胶原成分是Ⅱ型胶原,占总胶原量的90%~95%。软骨细胞会把合成的大量II型胶原、蛋白多糖(PG)等物质分泌到ECM中,构成细胞外纤维网架,给细胞提供支持与保护。Ⅱ型胶原同化异化平衡的改变及蛋白多糖的流失是关节软骨丧失其正常生物力学特性的直接原因,其变化与骨关节炎(OA)、类风湿关节炎(RA)的滑膜病变有着密切关系。

图5可见,胶原的代谢差异较大,后者关节腔已经充满胶原蛋白,这是AS的重要病理因素今后的研究重点应该围绕如何使胶原在OA、RA、强直性脊柱炎(AS)等关节炎中平衡,分析这类疾病发生和发展的重点因素,找到防治的节点。

实验中提示,刺激后胶原的反应面积大小次序为心血管>肾血管>肺血管>肝血管,这与疾病的发生和发展程度相似。药物治疗可以适当平衡胶原的代谢,增减胶原蛋白是一个非常关键的问题。

5 参考文献

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[2] 刘慧纯,张培培,王世民, 等.脐带间充质干细胞移植治疗大鼠脑缺血损伤[J].中国组织工程研究,2012,16(19):3471-3475.

[3] 孟祥奇,黄桂成,惠礽华,等,黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变软骨细胞II型胶原和蛋白多糖mRNA表达的影响[J].辽宁中医药大学学报,2012,14(6):35-37

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