健膝丸对大鼠膝骨关节炎SOD、MDA、NO的影响

赵幸熬　娄玉钤　张广辉　李坚

【摘 要】目的：通过观察健膝丸对膝骨关节炎模型SD大鼠血清SOD、MDA、NO表达水平的影响，以探求健膝丸在防治膝骨关节炎方面的作用机理，从而为本药的临床应用及药物开发提供科学的理论依据，同时进一步探索骨关节炎的发病机制。方法：以40只雌性SD大鼠为实验对象，随机分为正常组、模型对照组、健膝丸组、抗骨增生胶囊组，每组10只。除正常组外，其余各组均采用改良Hulth法对大鼠进行造模。术后连续3 d肌肉注射青霉素20万U，1周后开始强迫大鼠每天活动0.5 h，连续8周。同时各组大鼠均采用灌胃给药途径给予相应药液，根据人与动物体表面积等效剂量折算出健膝丸组及抗骨增生胶囊组灌胃给药量。正常组及模型对照组给予质量浓度0.9%的生理盐水，连续8周。8周后分别抽取各组大鼠腹腔静脉血，离心后取上清，按照SOD、MDA、NO测试盒说明操作，用754分光光度计测各管吸光度（OD值），从而进一步计算出各组血清中的各指标的含量。结果：血清中SOD、MDA、NO含量测定结果显示，模型对照组与正常组比较，模型对照组血清中SOD活性显著下降（P < 0.01），MDA、NO含量显著升高（P < 0.01）。健膝丸组与正常组比较，SOD活性差异无统计学意义（P > 0.05），MDA及NO含量差异有统计学意义（P < 0.05）。健膝丸组与模型对照组比较，SOD活性显著升高（P < 0.01），MDA含量差异无统计学意义（P > 0.05）、NO含量显著下降（P < 0.01）。对SOD、MDA、NO含量的影响，健膝丸组与抗骨增生胶囊组比较，差异无统计学意义

（P > 0.05）。结论：通过对实验各组SD大鼠血清中SOD、MDA、NO水平的检测，结果显示，在膝骨关节炎模型SD大鼠血清中， SOD活性下降，MDA及NO含量升高，由此可知氧自由基等因子在骨关节炎的发病及软骨细胞的破坏进程中起到重要作用。健膝丸对血清MDA的含量影响不明显，但可显著提高SOD活性、清除体内过量的氧自由基，同时抑制了NO的过度产生、降低其生物效应，改善关节微循环、保护软骨细胞或促使受损细胞的修复，从而起到延缓关节软骨退变的作用。

【关键词】 骨关节炎，膝；健膝丸；软骨细胞；血清SOD；血清MDA；血清NO；大鼠

健膝丸是全国名老中医娄多峰教授治疗膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的经验方，经长期的临床运用及观察发现，健膝丸可减少大鼠骨关节炎（osteoarthritis，OA）软骨Ⅱ型胶原和蛋白多糖丢失，减轻关节软骨破坏，减缓软骨下骨硬化，延缓OA的发展进程[1]。本实验采用复制KOA实验动物模型的方法，从观察血清生化指标的角度入手，深入研究健膝丸治疗KOA的作用机制。

1 实验材料

1.1 供试品 健膝丸（药物组成：制首乌、淫羊藿、千年健、海桐皮、鸡血藤、川牛膝、木瓜等），每1 g药片含原生药3.017 g，河南风湿病医院院内制剂，豫药制字Z04010008。

1.2 对照品 抗骨增生胶囊（药物组成：熟地黄、鸡血藤、肉苁蓉、莱菔子、狗脊、骨碎补、女贞子、牛膝、淫羊藿等），江苏康缘药业股份有限公司生产，国药准字Z10980006。

1.3 实验动物 40只雌性健康4月龄SD大鼠，清洁级，空腹体质量200～220 g，购自郑州大学实验动物中心，动物质量合格证号0003224。

1.4 主要仪器 754分光光度计，上海第三分析仪器厂生产；FA104 型电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司生产；SHH1WH-420型高效三用恒温水箱，天津市泰斯特仪器有限公司生产；TDZ42WS低速自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产。

1.5 主要试剂 注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号E0910401；硫化钠，天津市德恩化学试剂有限公司，批号20080102；戊巴比妥钠，上海西唐生物科技公司，批号20080615；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒，南京建成生物工程研究所，批号20090626；丙二醛（MDA）测试盒，南京建成生物工程研究所，批号20090626；一氧化氮（NO）测试盒，南京建成生物工程研究所，批号20090626。

2 方 法

2.1 动物分组 SD大鼠在自然光照、自由进食水、常温条件下饲养，以适应环境。1周后称重，采用区组随机法将大鼠分为正常组、模型对照组、健膝丸组、抗骨增生胶囊组，每组10只。

2.2 造模方法 正常组给予假手术处理，仅打开关节腔，不损伤韧带和半月板，缝合皮肤，无菌辅料包扎。其余各组均采用改良Hulth法进行手术造模。术前1 d用质量浓度8%硫化钠水溶液对各组大鼠右下肢进行脱毛，术前用质量浓度2%戊巴比妥钠对大鼠行腹腔注射以麻醉。麻醉成功后，各大鼠右膝常规消毒、铺无菌巾，取大鼠右膝关节内侧为手术入路，范围长约1 cm，在显微镜下切断内侧副韧带及前后交叉韧带，摘除内侧半月板，行抽屉试验检查，呈阳性后，无菌敷料包扎，手术结束。术后伤肢不进行固定，使其自由活动。术后各组大鼠，行抗感染治疗，肌肉注射青霉素20万U，连续3 d，以预防感染。1周后开始强迫大鼠活动，每日1次，每次0.5 h，连续8周。

2.3 药物配制及给药 术后1周，在造模的同时，开始给药。根据人与动物体表面积等效剂量折算，抗骨增生胶囊用质量浓度0.9%生理盐水加热配成

0.472 5 g·kg-1的溶液（临床常用量），健膝丸用质量浓度0.9%生理盐水加热配成1.35 g·kg-1的溶液，相当于原药15 g（临床常用量）。用药各组灌胃给予相应药液，正常组和模型对照组则按1 mL·（100 g）-1

给予等体积质量浓度0.9%生理盐水灌胃给药，每日1次，连续8周。

2.4 标本的采集与制备 8周后，分别麻醉各组动物后置于手术台，仰卧位，腹壁消毒，铺无菌巾。腹中部切开，取腹腔静脉血5 mL，静置2 h后放入离心机3 000 r·min-1离心5 min，取上清，置-20 ℃

冰箱保存备用。

2.5 实验指标的检测

2.5.1 754分光光度计的使用 用754分光光度计，在相应波长下测各管吸光度值（OD值）。

2.5.2 SOD的测定 用黄嘌呤氧化酶法，操作按其说明书进行。每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位（U），总SOD活力含量（U·mL-1）=（对照管吸光度-测定管吸光度）/（对照管吸光度）/ 50%×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数。

2.5.3 MDA的测定 用TBA（硫代巴比妥酸）法，操作按其说明书进行。MDA含量（nmol·mL-1）=

（测定管吸光度-测定空白管吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光度）×标准品浓度×样本测试前稀释倍数。

2.5.4 NO的测定 用硝酸还原酶法，操作按其说明书进行。NO含量（?mol·L-1）=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准品浓度×样本测试前稀释倍数。

2.6 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以表示，组间差异显著性检验采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各健膝丸组SD大鼠例数说明 在实验过程中，正常组、抗骨增生胶囊组大鼠因灌胃操作失误分别死亡2只、1只。因术后伤口感染严重，模型对照组剔除2只，健膝丸组及抗骨增生胶囊组各剔除1只。

3.2 血清中SOD、MDA、NO的含量测定 模型对照组与正常组比较，模型对照组血清中SOD活性显著下降（P < 0.01），MDA、NO含量显著升高

（P < 0.01）；健膝丸组与正常组比较，SOD活性差异无统计学意义（P > 0.05），MDA及NO含量差异有统计学意义（P < 0.05）。健膝丸组与模型对照组比较，SOD活性显著升高（P < 0.01），MDA含量差异无统计学意义（P > 0.05），NO含量显著下降（P < 0.01）。健膝丸组与抗骨增生胶囊组比较，对SOD、MDA、NO含量的影响，差异无统计学意义（P > 0.05）。

4 讨 论

现代西医学认为，OA的病变中心是软骨损伤。成熟软骨由软骨细胞及其分泌的细胞外基质共同组成，在力学因素和生物学因素的共同作用下，软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨三者间分解和合成代谢失衡导致了OA的发生，而这一失衡又是炎性介质、基质成分经与特殊受体结合传递信号进入细胞核，激活基质金属蛋白酶和炎性基因的转录，使关节细胞激活的结果[2-4]。在OA病理状态下，关节滑液、滑膜以及软骨细胞释放大量炎性介质及活性因子，它们之间的平衡与否决定着软骨细胞的损伤程度[5]。这些因子大致可分为3个亚型，在促分解性细胞因子中，主要有白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-1α（IL-1α）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。在OA病理状态下，体内IL-1α、IL-1β均升高，其不仅可以促进纤溶酶活性使软骨及基质受到破坏，还可以通过白细胞介素-6（IL-6）和内源性NO的介导抑制蛋白聚糖的合成及软骨细胞的增殖。TNF-α通过增加间质金属蛋白酶（MMPs）的活性来抑制基质中糖蛋白和胶原的合成，加速软骨基质的分解代谢。白细胞介素及肿瘤坏死因子不仅可使基质破坏，而且还可抑制其修复，增加二者任何一种都能导致显著的软骨和软骨下骨的退变。调节性细胞因子IL-6在OA的病变中起到既促进分解，又帮助修复和再生的双重作用[6]。与OA关系最密切的自由基代谢，是活性氧（ROS）的代谢，主要是超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、单线态氧4种。在OA病理状态下，氧自由基含量增高，过量的氧自由基抑制软骨细胞的增殖，促进其凋亡；加速软骨基质的降解、抑制其合成，从而导致软骨的损伤。体内存在的清除氧自由基的天然酶系统，主要有SOD，过氧化氢酶（Cat）和谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px），后两者清除氧自由基的前体或脂质过氧化物。SOD与MDA常作为配对指标，用以检测机体血氧自由基的水平，SOD活力的高低间接反映机体清除氧自由基的能力，而MDA含量的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，二者可作为动态评价OA防治效果的客观指标。NO在OA发病过程中是重要的炎症介质，高浓度的NO能抑制软骨细胞增殖，通过多条途径诱导软骨细胞凋亡，能抑制软骨细胞合成软骨基质，导致软骨组织破坏，促使OA的病理进展。软骨细胞的凋亡与NO水平的升高相关，抑制NO的产生，可抑制凋亡的产生[7]。

本课题通过实验研究，初步观察到健膝丸对OA血清中SOD、MDA、NO含量的影响表现出一定差异。健膝丸组与正常组比较，SOD活性无明显差异，MDA及NO的含量有一定差异。健膝丸组与模型对照组比较，SOD活性显著升高，NO含量明显下降，MDA含量无明显差异。由此可知，健膝丸可显著提高血清中SOD的活性，降低血清中NO的含量，对血清中MDA的含量无明显影响，从而起到延缓关节软骨退变的作用。

健膝丸以“虚邪瘀”理论为基础，同时结合“祛邪不伤正，扶正不助邪”的治疗原则[8]组方。方中制首乌性苦温，功善补肝肾、益精血；淫羊藿辛甘性温燥烈，长于补肾壮阳，散寒祛风胜湿；千年健辛散苦燥温通，既能入肝肾强筋骨，又可祛风逐痹；海桐皮辛散苦燥，功善祛风湿、通经络、止疼痛；鸡血藤性苦温，具有行血养血，舒筋活络之效；川牛膝性苦酸，不但补益肝肾、强筋健骨，而且活血祛瘀通络；木瓜性酸温，善舒筋活络，且能祛湿除痹。此方组方严谨，配伍精当，方义明确，攻补兼施，以达补益肝肾、强筋健骨、祛风除湿、活血通络止痛之功效。同时现代药理学证实，首乌中二苯乙烯苷、白藜芦醇苷有提高SOD和过氧化氢酶活性的功能；加之首乌多糖可以提高体内抗氧化酶活性，清除氧自由基及抑制脂质过氧化，从而消除自由基对机体的损伤[9]。淫羊藿对人及动物的非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫均具有良好的促进作用，并表现出双向调节效果[10]。鸡血藤具有调节免疫功能，采用DPPH法研究还发现其具有很强的抗氧化活性[11]。牛膝具有显著的镇痛作用，可增强体液免疫及非特异性免疫；以牛膝煎液灌服小鼠30 d，结果显示，牛膝煎液可显著提高小鼠体内SOD活性，降低血浆脂质过氧化物（LPO）的含量[12]。

木瓜中的齐墩果酸具有抗衰老、抗突变、清除自由基的作用；木瓜中的黄酮类物质可以有效清除氧自由基，防止生物膜脂质被超（下转第49页）

（上接第40页）氧自由基和羟自由基氧化；木瓜中的有机酸不但可以抗肿瘤而且具有镇痛的作用，木瓜多糖具有抗感染、御放射、抗衰老等作用，是理想的免疫增强剂[13]。千年健富含挥发油，其甲醇提取物具有显著的镇痛及抗炎效果。

综上所述，健膝丸能提高机体免疫功能，改善局部微循环，促进炎性物质的吸收，能提高机体内SOD的活性，清除过多的超氧自由基从而避免超氧自由基及其代谢产物对机体的损伤；抑制炎症因子NO的过量释放，从而抑制软骨细胞的凋亡水平，促进了软骨细胞增殖与软骨基质的合成，从而保护了软骨细胞，延缓了关节软骨退变的进展。虽然从统计学分析，健膝丸对血清中MDA含量的影响无意义，但是从数据上看，健膝丸组还是低于模型对照组，其具体作用机制及对其他细胞因子的影响，还需进一步研究。

5 参考文献

[1] 李坚，娄玉钤，李满意，等.健膝丸对大鼠膝骨关节炎组织形态学的影响[J].风湿病与关节炎，2013，2（1）：13-17.

[2] Goldring MB， Goldring SR.Osteoarthritis[J].J Cell Physiol，2007，213（3）：626-634.

[3] Pelletier JP， Martel-Pelletier J， Raynauld JP. Most recent developments in strategies to reduce the progression of structural changes in osteoarthritis：today and tomorrow[J].Arthritis Res Ther，2006，8：206.

[4] Berenbaum F.Signaling transduction target in osteoarthritis[J].Curropin Rheumatol，2004，16（5）：616-622.

[5] Kardel R，Ulfgren AK，Reinholt FP，et al.Inflammatory cell and cytokine patterns in patients with painful clicking and osteoarthritis in the temporomandibular joint[J].International Journal of Oral and Maxill of acial Surgery，2003，32（4）：390-396.

[6] 孙廊，张键.细胞因子在骨关节炎中的作用研究进展[J].

中国临床医学，2007，14（5）：690-692.

[7] Vuolteenaho K，Moilanen T，Jalonen U， et al. TGF beta inhibits IL-l-induced iNOS expression and NO production in immortalized chondrocytes[J]. Inflamm Res，2005，10：420-427.

[8] 娄玉钤，娄高峰，娄多峰，等.基于“虚邪瘀”理论的风湿病学科体系建立及相关研究[J].风湿病与关节炎，2012，1（1）：10-15.

[9] 谭凯丽.何首乌的药理作用研究进展[J].Journal of Mountain Agriculture and Biology，2010，29（1）：72-75.

[10] 李花.淫羊藿药理作用的研究现状及展望[J].现代医药卫生，2008，24（22）：3413-3414.

[11] 谢学明，钟远声，李熙灿.22种华南地产药材的抗氧化活性研究[J].中药药理与临床，2006，22（1）：48-50.

[12] 曹明俐，张小军，王振生.牛膝的药理作用研究进展[J].

中医药信息，2001，18（3）：20-21.

[13] 韩立敏.木瓜有效成分的研究[J].安徽农业科学，2009，37（23）：10969-10970.