胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血损伤后H2O2含量和CAT活性的影响

钟亮　张睿　纪晓军　吴艺玲　刘红玲　黄惠

[摘要] 目的 通过正交试验优化胡黄连苷Ⅱ治疗大鼠脑缺血损伤的最佳剂量和时间窗。 方法 应用双侧颈总动脉结扎法（BCCAO）建立大鼠前脑缺血模型，按照正交试验设计分组，经腹腔注射胡黄连苷Ⅱ干预治疗，应用光化学法测定血清和脑组织中过氧化氢（H2O2）的含量和过氧化氢酶（CAT）的活性。 结果 胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的最佳效果，根据血清和脑组织中H2O2含量分析，分别为脑缺血1.5 h/（10 mg·kg）和脑缺血1.5 h/（20 mg·kg）体重。根据血清和脑组织中CAT活性分析，分别为脑缺血1.5 h/（20 mg·kg）和脑缺血1.5 h/（10 mg·kg）体重。 结论 从用药剂量最小化和治疗时间窗最大化的角度综合评价，胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的治疗时间窗和剂量最佳组合为脑缺血1.5 h腹腔注射10～20 mg/kg体重。

[关键词] 胡黄连苷Ⅱ；脑缺血；剂量；时间窗；H2O2；CAT；大鼠

[中图分类号] R338；R364 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）09-20-03

脑缺血损伤导致能量代谢障碍、线粒体功能异常、离子平衡失调、兴奋性氨基酸释放[1-2]，体内抗氧化防御系统受损，氧自由基产生和清除失衡，使机体处于氧化应激状态[3-4]。氧自由基攻击生物膜中的多聚不饱和脂肪酸引起脂质过氧化反应，诱发细胞凋亡[5-6]。自由基清除剂通过降低脑组织氧化应激水平，践行缺血损伤程度[7-8]。过氧化氢酶（CAT）可将H2O2分解为分子氧和水，清除体内的H2O2[9]。细胞培养研究证实，胡黄连苷Ⅱ可减轻H2O2诱导的PC12细胞损伤[10]，抑制细胞线粒体膜电位的降低[11]。动物实验表明，胡黄连苷Ⅱ可抑制大鼠脑缺血半影区神经细胞凋亡，减小脑梗死体积而达到神经保护作用[12]。作者前期研究发现，在

大鼠脑缺血1.5 h腹腔注射20 mg/kg剂量胡黄连苷Ⅱ可取得最佳疗效[13]。本实验试图定量检测血清和脑组织H2O2水平和CAT活性的变化，探讨胡黄连苷Ⅱ在脑缺血损伤中的抗氧化作用及最佳治疗剂量和时间窗。

1 材料与方法

1.1 动物模型

成年健康雄性SPF级Wistar大鼠30只，体重230～250 g，青岛市药物检验所实验动物中心提供（SCXK20100010）。動物置实验室适应环境1周，自由进食、饮水；室温（23±2）℃，自然光照。随机取5只为假手术组，其余动物分离并结扎双侧经总动脉建立前脑缺血模型[14]。术前动物禁食12 h，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/kg），仰卧固定、无菌操作，术后2 h仍未苏醒或死亡的4只动物动物剔除，将成功的21只模型再随机分为模型组5只和治疗组16只。假手术组不结扎颈总动脉，其余操作同实验组。

1.2 设计分组

1.3 干预措施

胡黄连苷Ⅱ（CAS No：39012-20-9，纯度>98%）由天津奎青医药公司提供，应用生理盐水溶解稀释成1%溶液，按[L16（45）]正交表设计，在相应的缺血时间腹腔注射相应剂量胡黄连苷Ⅱ。假手术组和模型组术后2 h腹腔注射等量生理盐水。

1.4 标本采集

大鼠给药24 h后，以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉，开胸经心脏取血4 mL，4000 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存。然后立即经心脏灌注生理盐水200 mL，快速开颅，完整取脑，切除嗅球和额叶前部脑组织，自视交叉向后切取缺血部位脑组织500 mg，置预冷研钵中研磨至粉末状后按1∶4比例加细胞裂解液（碧云天生物技术研究所），超声波匀浆，4℃冷冻离心机（Eppendorf 5801型，德国）12 000r/min离心10 min，去沉淀组织留上清液，BCA法测定蛋白浓度，-20℃保存。

1.5 检测指标

应用光化学方法分别测定血清或脑组织匀浆中过氧化氢（H2O2）水平和过氧化氢酶（CAT）活性。按试剂盒（南京建成生物公司）说明书操作，取血清或脑组织匀浆室温复溶，离心取上清100μL，以紫外分光光度计（Beckmann DU640，USA）在波长751 nm（H2O2）和405 nm（CAT）处测定吸光度值，计算H2O2（mmol/L）含量和CAT（U/mL）活性。

1.6 统计学处理

应用SPSS17.0软件进行数据统计。根据结果分析不同水平的缺血（给药）时间和剂量以及时间-剂量交互作用对检测指标是否有显著性影响，得出最佳剂量和时间窗。

2 结果

交互作用（C）均无显著性影响（P>0.05）。应用最小显著差数法（LSD）对各组数据进行两两比较显示：血清H2O2含量在给药（缺血）时间1.0 h（A1）与1.5 h（A2）、1.0 h（A1）与2.0 h（A3）之间差异无统计学意义（P>0.05），其余给药时间两两比较均差异有统计学意义（P<0.05）；在给药剂量5 mg（B1）与10 mg（B2）之间差异有统计学意义（P<0.05），其余给药剂量两两比较均差异无统计学意义（P>0.05）。从治疗时间窗最大化和用药剂量最小化的角度考虑，以A2B2最好，即最佳治疗时间窗和剂量分别为缺血1.5 h和10 mg/kg体重。

2.3 CAT含量方差分析

不同水平的缺血时间（A）对血清CAT活性的影响有显著性影响（P<0.01），而给药剂量（B）和时间-剂量交互作用（C）差异均无统计学意义（P>0.05）。LSD两两比较显示：血清CAT活性在给药（缺血）时间1.0 h（A1）与2.0 h（A3）之间差异无统计学意义（P>0.05），其余给药时间两两比较均差异有统计学意义（P<0.05）；在给药剂量5 mg（B1）与20 mg（B3）、10 mg（B2）与40 mg（B4）、20 mg（B3）与40 mg（B4）之间差异有统计学意义（P<0.05），其余给药剂量两两比较均差异无统计学意义（P>0.05）。根据治疗时间窗最大化和给药剂量最小化原则，以A2B3最好，即最佳治疗时间窗和剂量为脑缺血1.5 h腹腔注射20 mg/kg体重。

缺血时间（A）和给药剂量（B）对脑组织中CAT的活性均有显著性影响（P<0.05），而时间-剂量交互作用（C）差异无统计学意义（P>0.05）。LSD两两比较显示：脑组织中CAT活性在给药（缺血）时间1.0 h（A1）与2.5 h（A3）、1.5 h（A2）与2.0 h（A3）、1.5 h（A2）与2.5 h（A4）之间差异有统计学意义（P<0.05），其余给药时间两两比较均差异无统计学意义（P>0.05）；在给药剂量5 mg（B1）与40 mg（B3）、10 mg（B2）与20 mg（B4）之间差异无统计学意义（P>0.05），其余给药剂量两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。根据治疗时间窗最大化和给药剂量最小化原则，以A2B2最好，即最佳治疗时间窗和剂量为脑缺血1.5 h腹腔注射10 mg/kg体重。

3 讨论

胡黄连为我国传统中药，主要生物活性成分是环烯醚萜甙类化合物，具有抗炎、抗氧化等作用[10]。细胞培养发现，胡黄连甙Ⅱ对H2O2导致的PC12细胞损伤也有明显保护作用，考虑与其直接清除氧自由基及增强细胞本身抗氧化系统功能有关[11]。动物实验表明，胡黄连苷Ⅱ可保护模型大鼠神经功能，其神经保护作用与胡黄连苷Ⅱ提高模型大鼠脑组织的抗氧化能力、减少脑缺血再灌注所致的氧化性损伤有关[15]。本实验检测指标H2O2可以直接反应出脑缺血损伤时体内自由基含量的变化，CAT则可以体现脑缺血损伤时体内抗氧化物质含量的变化。按[L16（45）]正交试验设计分组，通过检测H2O2和CAT指标，结果表明给药时间和用药剂量对于胡黄连苷Ⅱ的治疗效果均有显著性影响，不同检测指标最佳组合不尽一致，从用药剂量最小化和治疗时间窗最大化的角度考虑，以A2B2和A2B3组合最好，即最佳治疗时间窗和剂量分别为脑缺血1.5 h腹腔注射10～20 mg/kg体重。由于脑缺血损伤的机制目前尚不十分明确，本研究仅观察了以上上述指标的变化，难免有所偏差。因此，胡黄连苷Ⅱ的确切作用机制和最佳治疗时间窗和给药剂量尚有待于进一步综合评价。

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（收稿日期：2013-04-17）