Q—开关激光对黄褐斑动物模型黑素细胞病理形态的影响

杨鹏　杨慧兰　麦跃　戴勇　孙林潮　鲁东平

[摘要]目的：探讨Q-开光1064nm Nd：YAG激光不同能量照射对黄褐斑动物模型表皮黑素细胞病理形态的影响。方法：用Q-开关1064nm Nd：YAG激光不同能量和频率照射黄褐斑动物模型背部皮肤，分别于激光照射前和照射后不同阶段取材，通过HMB45免疫组化染色法，光镜观察豚鼠表皮黑素细胞的变化。结果：第一次激光照射后即刻可见高能量两组黑素阳性细胞减少，第5次激光照射后即刻可见低能高频组黑素阳性细胞减少。与术前比较，低能量密度低频率照射组黑素细胞阳性细胞数无显著差异。5次治疗后软件分析结果显示，高能高频、高能低频和低能高频组与照射前比较黑素细胞阳性目标个数、平均数密度、平均光密度下降，但平均灰度值上升，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：高能量密度Q-开光 Nd： YAG激光照射对表皮黑素细胞的影响大于低能量密度，当其超过一定阈值时能高能量高频率可导致黑素细胞的损伤和减少。从而为临床应用Q-开关1064nm Nd：YAG激光治疗色素性疾病提供了实验依据。

[关键词]激光；黑素细胞；黑素；光镜；动物模型

[中图分类号]R758.4+2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）09-0941-06

Q-开关激光技术的应用和选择性光热作用原理的提出[1-2]，色素增加性疾病的治疗取得丰硕的成果，对于黄褐斑的治疗虽然疗效也令人比较满意[3-4]，但褒贬不一样，同时还是存在一定的副作用和治疗风险[5]。目前对Q-开关Nd：YAG 激光治疗色素增加性皮肤病机理的认识主要还是选择性光热作用理论的光致破裂作用，而对Q-开关Nd：YAG激光照射可能存在的对表皮黑素细胞生物学和病理形态的影响却并不清楚。黑素细胞是皮肤唯一能合成黑素的细胞， 是多种皮肤色素沉着性疾病的靶细胞，并参与皮肤的免疫反应和光老化的过程。对激光照射黑素细胞的病理形态研究为Q-开关Nd：YAG激光有效用于临床黄褐斑的治疗提供基础实验和理论依据。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：根据文献[6]制作慢性应激抑郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型12只。

1.1.2主要试剂和仪器：HMB45 （melanoma 黑素瘤） 鼠抗人单克隆抗体即用型试剂盒（福建迈新公司）；Q-switched Nd：YAG激光仪（Medlite C6，美国HoYa-ConBio公司）；光学显微镜（Olympus公司）。

1.2 实验方法

1.2.1照射方法：取慢性应激抑郁型小鼠黄褐斑实验动物模型造模12只，将每只小鼠裸露皮肤划分成A（左上区域）、B（右上区域）、C（左下区域）、D（右下区域）四个区域。分别代表不同参数治疗区。A区代表高能量低频率区：3mm光斑 2.5J/cm2，频率1Hz；B区代表高能量高频率区：3mm光斑，2.5J/cm2，频率10Hz；C区代表低能量高频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率10Hz；D 区代表低能量低频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率1Hz。每组照射1分钟，每周照射一次，共照射5次。实验设每只小鼠自身激光术前为对照。

1.2.2取材方法：分别于激光治疗术前，第1次术后即刻、第5次术后即刻、术后1周、术后3周五次分别切取不同治疗区约1.0cm×0.2cm全层去毛皮肤一条，术后丝线缝合。根据组织病理和细胞培养观察需要进行处理保存。其中第一次照射前的取材为正常对照。

1.2.3 HMB45免疫组化方法[7]：10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。黑色素标记采用免疫组织化学技术-链霉菌素·生物素法，再经脱蜡至水化、抗原修复后，用HMB45（melanoma黑素瘤）为第一抗体，免疫组化二步法，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗做阴性对照。

1.2.4 显微镜图像分析[8]：采用病理图像分析系统对目标图像进行定量分析，每张切片随机在显微镜物镜400×下选择5个不重叠视野进行彩色图像采集与存储，计算出每个视野中的阳性目标面积、目标个数、平均灰度值等。

1.3统计学处理：SPSS17.0统计学软件，数据以（x±s）表示，计量数据采用t检验。组间差异运用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肉眼观察：治疗后创面均出现轻微红肿，高能量区针尖样出血，2～3日后逐渐结痴，5～6日后开始脱落。低能量区皮肤微红，高能高频区第三次照射后开始出现点状白斑，其他两组与低能低频区激光治疗区照射后1周豚鼠皮肤颜色相比减淡明显。

2.2皮肤黑素细胞的病理形态学观察 激光术前可见豚鼠表皮基底细胞和棘细胞层中可见成簇分布的黑素细胞，呈强阳性反应。第5次照射后即刻可见高能量高频率和高能量低频率照射组黑素阳性细胞数量明显减少。低能高频组照射后一周可见黑素阳性细胞数量少量减少（图1）。

2.3激光照射后对各区豚鼠皮肤黑素细胞阳性目标数量、数密度影响：数密度是指细胞个数与靶目标面积的比值，是形态计量学中衡量空间中某种粒子数目多少的结构参数。

2.3.1豚鼠皮肤黑素细胞数密度比较： 采用单因素方差分析各时间点比较，经5次照射后，高能高频、高能低频、低能高频组术后1 周豚鼠皮肤黑素细胞数密度呈下降趋势，差异有统计学意义（F=311.922，P<0.01；F=14.106，P<0.01；F=4.556，P<0.01）。高能高频组和高能低频组与术前比较在第1次激光照射后即刻明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频组与术前比较在第5次照射后即刻黑素细胞数密度下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能低频经5次照射后与术前对照比较，差异无统计学意义（P>0.05）。各组间比较：第1次激光照射后即刻高能量两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；低能量两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；而高能高频与低能量两组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；第5次照射后即刻、照射后一周、照射后三周各组间比较，差异有统计学意义（P<0.01）；低能低频组在每个时间上与其他各组比较，差异有统计学意义（P<0.01），见表1与图1。

2.3.2豚鼠皮肤黑素细胞阳性目标数量比较： 采用单因素方差分析各时间点比较，经5次照射后，高能高频、高能低频、低能高频组术后1 周豚鼠皮肤黑素细胞阳性目标数量呈下降趋势，差异有统计学意义（F=394.170，P<0.01；F=277.206，P<0.01；F=20.087，P<0.01）。采用最小显著差法比较高能高频组和高能低频组每次照射时间点与术前比较在第1次激光术后即刻明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频区在第5次术后即刻与与术前对照比较黑素细胞阳性目标数量明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能低频经5次照射后与术前对照比较，差异无统计学意义（P>0.05）。各组间比较：第1次激光照射后即刻高能低频与低能量两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；低能量两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；而高能高频与低能量两组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；第5次照射后即刻、术后一周、术后三周各组间比较，差异有统计学意义（P<0.01）；低能低频组在每个时间上与其他各组比较，差异有统计学意义（P<0.01），见表2与图2。

2.4小鼠表皮黑色素沉着深浅度： 豚鼠黑色素细胞染色深浅度用灰度值或光密度值表示，颜色越深，灰度值越小，光密度越大。

2.4.1平均灰度值比较： 采用单因素方差分析，随着5次照射后，高能高频组、高能低频组、低能高频组激光治疗术后1 周平均灰度值呈上升趋势，差异有统计学意义（F=301.183，P<0.01；F=341.980，P<0.01；F=132.389，P<0.01）。采用最小显著差法比较高能高频组和高能低频组每次照射时间点与照射前比较在第1次激光照射后即刻平均灰度值明显上升，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频组在第5次照射后即刻平均灰度值明显上升，差异有统计学意义（P<0.01）。低能低频组经5次照射后与术前对照比较，差异无统计学意义（P>0.05）。各组间比较：第1次激光照射后即刻高能量两组与低能量两组比较，差异有统计学意义（P>0.05）；低能量两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；高能高频与低频两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；第5次照射后即刻、照射后一周、照射后三周各组间比较，差异有统计学意义（P<0.01）；低能低频组在每个时间上与其他各组比较，差异有统计学意义（P<0.01），见表3和图3。

2.4.2平均光密度值比较： 采用单因素方差分析，随着5次照射后，高能高频组、高能低频组、低能高频组激光治疗照射后1 周平均光密度值呈下降趋势，差异有统计学意义（F=95.903，P<0.01；F=29.697，P<0.01；F=28.205，P<0.01）。采用最小显著差法比较高能高频组和高能低频组每次照射时间点与照射前比较在第1次激光照射后即刻平均光密度值明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频组在第5次照射后即刻平均光密度值明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。各组间比较：第1次激光照射后即刻高能两组与低能低频组比较，差异有统计学意义（P>0.05）；低能高频组与其他三组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；高能高频与高能低频两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；第5次照射后即刻、照射后一周、照射后三周各组间比较，差异有统计学意义（P<0.01）；低能低频组在每个时间点上与其他各组比较，差异有统计学意义（P<0.01），见表4与图4。

3 讨论

随着激光的诞生，成为黄褐斑一种新的治疗手段，早期根据选择性光热作用理论普遍使用Q-开关红宝石与翠绿宝石激光[10]及CO2激光[11]高能量治疗黄褐斑，但均不理想，结果显示：色素无明显改善的情况下大部分病例均出现色素加深，活检显示治疗后表皮和真皮受到损伤，数月后表皮色素才恢复到治疗前。从临床Q开关Nd：YAG激光治疗黄褐斑经验来看，当激光能量较以往治疗能量稍微偏高时，很容易出现黄褐斑病变区色素加深的现象[12]。随着激光多年的发展，Polnikorn[13]尝试以大光斑，小能量，高频率，多次治疗的方式治疗，报道取得良好效果，无色素沉着的副作用。渐渐此方法被广泛应用。Watanabe[14]认为激光在高能量下可能诱发了更严重的损伤，表皮炎症反应刺激表皮层的黑素细胞改变了黑素细胞和一些免疫细胞的活性[3]，甚至可以导致黑素合成增加，形成炎症后色素沉着。而大光斑、低能量、多次反复的方法可只针对黑素颗粒进行多次光爆破，可以使黑素颗粒更微小化，从而尽量避免或减少对黑素细胞的激活，使黑素细胞功能失活或抑制，这种理论即称为“亚细胞选择性光热解作用”[15]。Mun等[16]通过一种立体表面成像新技术观察MC的三维结构也证实了这一点，也可以最大程度减少激光对正常皮肤组织和基底膜的损害，避免PIH的发生。2010年，Wattanakrai等[17]提出虽然单次照射的能量密度较小，但是多次照射能量的累积可能超过了激光标准的安全能量，长期的安全性尚不清楚。临床中治疗样本的逐渐扩大，发现而低能量长时间治疗后又出现点状白斑[5]。提示低能量持续累加能量可能导致对黑素细胞的损伤。

该实验结果显示，高能高频、高能低频和低能高频组经5次照射后豚鼠皮肤黑素细胞阳性个数、数密度、光密度值不同程度降低，平均灰度值上升。并且高能量不同频率组在第一次照射后即刻就对色素细胞产生影响，高能和低能两组的比较提示与Polla等[18]实验结果一致，激光对黑素细胞的作用与激光流量相关，高能量可能直接导致黑素细胞和周围组织的损伤，通过表皮炎症反应激活了黑素细胞，导致黑素合成增加，形成炎症后色素沉着。高能高频区第二次照射后出现点状白斑，可能激光在高频能量照射下超过黑素细胞自身存活耐受能量，或对周围组织损伤过大，导致局部色素减退。低能量低频率组5次照射后未见明显变化，而低能量组通过高频多次照射后同样显示出豚鼠皮肤黑素细胞阳性个数、数密度、光密度值不同程度降低，平均灰度值上升。说明低能量连续多次的能量累加可以造成对黑素细胞的影响。也就是说当激光照射的能量密度累积达到一定阈值时，会对黑素细胞造成一定的影响。近来国内外有大量研究表明[16]，大光斑、低能量密度多次治疗与高能量、小光斑少次治疗疗效一致，但减少了不良反应的发生，本研究结果与之相符。从而指导我们临床激光治疗中能量和频率的选择，当我们需要选择大能量进行爆破些，尽量选择低频率以减少对黑素细胞和周围组织的损伤。对于色素细胞活性增强皮肤病治疗，为减少过高的能量参数会出现长时间的炎症后红斑，可能引发PIH或者色素脱失斑，甚至引起瘢痕形成，可使用低能量高频率多次治疗。同时，黑素细胞对累积激光照射能量密度耐受阈值，有待进一步研究。为利于将来黄褐斑的激光治疗制定个性化治疗方案。

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[收稿日期]2013-04-06 [修回日期]2013-05-03

编辑/张惠娟