醒智散对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善作用及其机制※

邹 勇 张凤兰 付毅敏

（1山东省烟台毓璜顶医院中西医结合科，烟台264000；2山东省烟台毓璜顶医院眼科，烟台264000；3山东省烟台毓璜顶医院保健科，烟台264000）

醒智散对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善作用及其机制※

邹 勇1张凤兰2付毅敏3

（1山东省烟台毓璜顶医院中西医结合科，烟台264000；2山东省烟台毓璜顶医院眼科，烟台264000；3山东省烟台毓璜顶医院保健科，烟台264000）

目的 观察醒智散对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善作用，并研究其可能的机制。方法通过反复夹闭双侧颈总动脉同时腹腔注射硝普钠的方法制备血管性痴呆大鼠模型。然后将大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、醒智散小、中、大剂量组，每组20只。各组给予相应药物或溶媒，1次／d，连续7d。在第3d各组随机抽取10只大鼠进行脑内氧化损伤相关因子SOD、MDA以及凋亡抑制因子Bcl-2检测；第8d开始，给药同时用Morris水迷宫检测各组大鼠空间学习记忆能力；第14d学习记忆测试结束后，检测脑组织海马病理以及乙酰胆碱酯酶活性。结果第3d：与假手术组比较，模型组大鼠脑内SOD、Bcl-2表达显著降低，MDA显著增加；与模型组比较，醒智散中、大剂量能提高脑内抗氧化因子SOD、抗凋亡因子Bcl-2的表达，降低氧化产物MDA的产生。第14d：与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期延长，海马区存活海马神经元显著减少；与模型组比较，尼莫地平和醒智散中、大剂量能显著缩短血管性痴呆大鼠的逃避潜伏期，但没有显著影响乙酰胆碱酯酶的活性；尼莫地平和醒智散中、大剂量能显著降低海马神经元损伤，增加存活神经元数目。结论醒智散对血管性痴呆大鼠学习记忆能力有改善作用，其机制可能与抗氧化、抗神经细胞凋亡有关。

血管性痴呆；醒智散；学习记忆；SOD；MDA；Bcl-2

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是各种脑血管疾病导致的认知功能障碍的临床综合征，是一种慢性进行性疾病。在祖国医学属于“呆病”范畴，多发生于中风病之后，其病位在脑，病因病机错综复杂，病理性质为本虚标实，与肾、心、肝、脾、肺关系密切，痰瘀阻络为标，脑窍失养致呆为本病的发病基础。本文作者在中医学理论和临床实践基础上，在《证治准绳》“不忘散”原方基础上，结合多年临床治疗血管性痴呆的经验，以“不忘散”方去茯神，加葛根、丹参、天竺黄，创制了“醒智散”颗粒剂，临床用于血管性痴呆病人的治疗，能显著改善病人的学习记忆能力，但作用机制不清。本研究通过在血管性痴呆大鼠模型上应用醒智散，拟明确醒智散改善痴呆患者学习记忆能力的可能机制。

1 材料

1.1 实验动物普通级雄性Sprague Dawley大鼠，体重220～250g，山东绿叶制药有限公司实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2009 0009。

1.2 试剂、仪器醒智散：颗粒状。

尼莫地平片：购自天津市中央药业有限公司。

碘化乙酰胆碱，购自Sigma公司。

SOD检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所，批号：20120109。

MDA检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所，批号：20120308。

大鼠Bcl-2抗体：购自Abcam公司。

羊抗兔二抗，组织裂解液，ECL发光液，SDS-聚丙烯酰胺凝胶配制盒，显影、定影液，均购自碧云天生物技术研究所。

Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所生产。

酶标仪：Biotek公司。

切片机：Leica公司。

2 方法

2.1 血管性痴呆大鼠模型制备参考文献［1］描述方法制备血管性痴呆大鼠模型。大鼠术前12 h禁食，4h禁水，用10%水合氯醛（350mg／kg）麻醉。麻醉成功后，将大鼠仰卧固定在手术台上，颈前部去毛，常规消毒，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉（CCA），模型组及药物治疗组在夹闭双侧CCA之前，腹腔注射硝普钠（2.5mg／kg），随即用动脉夹夹闭双侧CCA10min，再通10min，共间歇阻断、再通双侧CCA血流3次。然后缝合伤口。假手术组仅分离双侧CCA，但不夹闭CCA及注射硝普钠。造模过程中保持大鼠肛温在37℃，术后连续3d给予青霉素预防感染。

2.2 动物分组及给药将120只大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平（10 mg／kg）组、醒智散小剂量（3g／kg）、醒智散中剂量（6g／kg）、醒智散大剂量（9g／kg）组，每组20只。按上述方法制作大鼠血管性痴呆模型，各组动物手术完成0.5 h后分别给予相应药物。每天1次，连续14 d。在第3 d每组随机抽取10只大鼠，进行脑内氧化损伤相关因子SOD、MDA以及凋亡抑制因子Bcl-2检测。第8～14d进行空间学习记忆训练和测试，测试结束后进行脑组织海马病理检测和AChE检测。

2.3 空间学习记忆能力测试采用morris水迷宫实验法。正式实验历时5d，每天训练1次，每次120s，从平台所在象限的相邻象限中选择一个入水点，将动物面向池壁放入水中，记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期（escape latency）。如果动物在120s内未找到平台，则由实验者将其引至平台停留20s，逃避潜伏期记为120s。

2.4 脑组织样品处理及H-E染色水迷宫实验结束后，每组随机取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉，将其仰卧于平台上，伸展固定四肢，剪开胸腹充分暴露心脏和肝脏。剪开左侧心尖部，迅速插导管于左心室至升主动脉并固定，同时剪开右心耳。快速灌注生理盐水至肝脏完全变白，右心室流出澄清液体后，换用4%多聚甲醛固定液灌注约100ml至大鼠肝脏变硬，肢体僵直，即固定完成。然后断头，完整取出鼠脑后投入含20%蔗糖的多聚甲醛溶液中后固定24h以上（4℃）。待脑组织下沉后，石蜡包埋，5μm厚度切片，H-E染色，光学显微镜下观察海马病理变化。

2.5 胆碱酯酶活性检测水迷宫实验结束后，大鼠麻醉处死，在冰上迅速取出全脑，分离海马组织称重，按质量比1∶9的比例加入生理盐水，匀浆，3000r／min离心10min，取上清（待测样品）。在96孔板上，每孔加入0.1 M PBS 30μl，待测样品30μl，最后加入10 mM碘化乙酰胆碱30μl，振荡混匀，放入37℃恒温培养箱内孵育30min，加入1 M HCl 10μl终止反应。放置20min后加0.03%DTNB（用0.3M PBS配制）200μl，总体积为300μl，震荡混匀，405nm测定OD值。AChE活性用U／g蛋白表示。

2.6 SOD、MDA检测每组随机取5只大鼠，麻醉处死，在冰上迅速取出全脑，分离海马组织称重，按质量比1∶9的比例加入生理盐水，匀浆，3000 r／min离心10 min，取上清（待测样品）。按照SOD、MDA试剂盒说明书进行检测。

2.7 Bcl-2检测每组随机取5只大鼠，麻醉处死，在冰上迅速取出全脑，分离海马组织称重。加入裂解液充分裂解，14000rpm 4℃离心5min。取上清液用BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液，煮沸5min，-20℃冰箱保存备用。制备12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每道上样25μg，160V电泳。然后在106 V条件下转膜70min。TBST洗膜1次，放入含有5%脱脂奶粉的封闭液中封闭2 h。加入Bcl-2（1∶1000）一抗孵育过夜。TBST洗膜4次，每次5min。加入羊抗兔二抗（1∶2000）室温孵育2h。TBST洗膜4次，每次5min。在膜上滴加400μl ECL发光液，放入暗盒，压上胶片，曝光5 min。显影、定影，对图像分析。

2.8 统计方法数据采用（±SD）表示，组间比较先检验资料的正态性和方差齐性，方差不齐者采用秩和检验，符合条件者采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 醒智散对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响各组大鼠的逃避潜伏期随训练次数增加均呈下降趋势。第3、4d，模型组大鼠的逃避潜伏期与正常组相比明显延长（P＜0.05）；尼莫地平与醒智散大剂量组与模型组相比逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05）；而醒智散小、中剂量组与模型组比较未见显著差异。第5 d，醒智散中、大剂量组、尼莫地平组与模型组相比逃避潜伏期显著缩短（P＜0.01）。见表1、图1。

表1 醒智散对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响±S，n＝10）

表1 醒智散对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响±S，n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.05；与假手术组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

级别day 1 day 2 day 3 day4 day 5假手术83．7±18．8 69．7±16．2 48．8±16．0 48．4±16．3 42．4±12．3模型94．4±14．3 88．6±24．3 88±25．1▲▲79．3±16．5▲▲76．8±17．8▲▲尼莫地平81．5±19．2 67．6±25．9 62±18．8*57．2±19．5*47．9±15．4**醒智散（小）88±22．1 85．3±16．3 74±15．7 72±19．0 60．9±17．5醒智散（中）84．7±28．0 71．9±15．1 68．3±16．0 67．1±17．4 49．8±12．0**醒智散（大）79．3±20．0 73．6±18．9 56．8±18．3*53±21．4*48．30±16．5**

图1 醒智散对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响（±SD，n＝10）

3.2 醒智散对血管性痴呆大鼠海马AChE活性的影响

与模型组比较，尼莫地平与醒智散各剂量组对AChE活性未见显著影响。见表2、图2。

表2 醒智散对血管性痴呆大鼠海马AChE活性的影响±S，n＝7）

表2 醒智散对血管性痴呆大鼠海马AChE活性的影响±S，n＝7）

注：与模型组比较，*P＜0.01

组别剂量AChE活性（U／g蛋白）假手术—4．1±1．3模型—3．4±0．5尼莫地平10mg／kg 2．9±0．6醒智散（小）3g／kg 3．3±0．4醒智散（中）6g／kg 3．1±0．6醒智散（大）9g／kg 3．3±1．2

图2 醒智散对血管性痴呆大鼠海马AChE活性的影响

3.3 醒智散对血管性痴呆大鼠海马神经元损伤的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马神经元受损严重，存活神经元数目显著减少。与模型组比较，尼莫地平和醒智散中、大剂量能显著降低海马神经元损伤，增加存活神经元数目。见图3。

图3 醒智散对血管性痴呆大鼠海马神经元损伤的影响（放大倍数10×40）

3.4 醒智散对血管性痴呆大鼠海马SOD、MDA产生的影响与假手术组比较，模型组大鼠海马区MDA产生明显增多，SOD明显降低。与模型组比较，尼莫地平和醒智散大剂量能显著降低海马区MDA含量，增加SOD含量。

表3 醒智散对血管性痴呆大鼠海马SOD、MDA产生的影响±SD，n＝5）

表3 醒智散对血管性痴呆大鼠海马SOD、MDA产生的影响±SD，n＝5）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.05；与假手术组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别剂量SOD（U／mg）MDA（nmol／mg）假手术—68．6±6．1 2．6±0．3模型—50．4±7．1▲▲3．4±0．3▲▲尼莫地平10 mg／kg 62．4±6．1*2．7±0．5*醒智散（小）3g／kg 53±10．2 3．1±0．3醒智散（中）6g／kg 62．2±7．0*3．1±0．4醒智散（大）9g／kg 66．4±7．7**2．8±0．4*

3.5 醒智散对血管性痴呆大鼠海马区凋亡抑制分子Bcl-2表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠海马区Bcl-2表达明显减少；与模型组比较，醒智散中、大剂量能显著提高海马区Bcl-2表达。见图4。

图4 醒智散对血管性痴呆大鼠海马区凋亡抑制分子Bcl-2产生的影响

4 讨论

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是由脑血管因素引起的脑组织受损导致的一种认知功能障碍综合征。血管性痴呆在我国所占比例较高（10%～50%），仅次于阿尔茨海默病，严重影响患者的生存质量。目前，尚缺乏理想的血管性痴呆治疗药物。

本文作者在中医学理论和临床实践基础上，在《证治准绳》“不忘散”原方基础上，结合多年临床治疗血管性痴呆的经验，以“不忘散”方去茯神，加葛根、丹参、天竺黄，创制了“醒智散”颗粒剂，临床用于血管性痴呆病人的治疗，能显著改善病人的学习记忆能力，但作用机制不清。因此本实验制备了大鼠血管性痴呆模型，拟进一步明确醒智散治疗血管性痴呆的可能机制。

目前血管性痴呆动物模型有四血管结扎法、两血管结扎结合硝普钠法以及大脑中动脉栓塞法等。本实验采用反复夹闭、再通双侧颈总动脉加硝普钠法制备大鼠血管性痴呆模型，很好地模拟了人类血管性痴呆的发病过程，最终导致大鼠海马神经元损伤和学习记忆功能障碍［2］。醒智散能显著减轻血管性痴呆大鼠海马神经元损伤，提高大鼠的学习记忆能力。进一步在动物模型上验证了醒智散治疗血管性痴呆的良好疗效。

体内氧自由基过量，引起组织氧化损伤，是导致血管性痴呆的重要因素之一。清除自由基可防止组织过氧化损伤，延缓痴呆病情。MDA是脂质过氧化生成物，其产生的多少可反映机体受自由基损伤的程度。SOD具有清除自由基、抑制脂质过氧化的作用，提高体内SOD活性，可以保护细胞免受自由基的伤害。本实验通过脑缺血再灌注制备血管性痴呆模型，可触发脑组织中自由基的过量产生。而给予中药醒智散，可显著提高脑组织SOD活性，大大降低MDA的含量。结果表明醒智散具有明显的抗氧化能力［3-4］。

细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡的过程。而在参与调控神经元凋亡的分子中，Bcl-2发挥着至关重要的作用。据报道在大脑中动脉栓塞所致的局灶性脑缺血模型，人为增加脑内Bcl-2的表达，可减少神经细胞的凋亡，提示Bcl-2在缺血缺氧导致的神经细胞损伤中起到了保护作用［5］。本实验显示，醒智散能显著提高Bcl-2在海马神经元的表达，提示其能通过抗凋亡作用保护受损神经元。

［1］刘斌，毛文静，李爱春，等．参芎化瘀胶囊对血管性痴呆大鼠海马CA1区p38丝裂原活化蛋白激酶表达的影响［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16（8）：161-165．

［2］王蕊，杨秦飞，唐一鹏，等．大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进［J］．中国病理生理杂志，2000，16（10）：914-6．

［3］王金萍，王占庆，曾明，等．健脑口服液对血管性痴呆大鼠学习记忆及脑组织SOD、MDA和AchE活性的影响［J］．中国老年学杂志，2010，30（17）：2479-80．

［4］Li RP，Wang ZZ，Sun MX，et al．Polydatin protects learning and memoryimpairments in a rat model of vascular dementia［J］．Phytomedicine，2012，19（8-9）：677-81．

［5］Sulejczak D，Czarkowska-Bauch J，Macias M，et al．Bcl-2 and Bax proteins are increased in neocortical but not in thalamic apoptosis following devascularizing lesion of the cerebral cortex in the rat：an immunohistochemical study［J］．Brain Res，2004，1006（2）：133-49．

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.20.105

1672-2779（2013）-20-0154-03

杨 杰

2013-08-26）

山东省烟台市科技发展计划项目［No：2011223］