密码子优化提高aiiaB546毕赤酵母表达活性

张宇婷曹雅男解绶启周志刚

(1. 中国农业科学院饲料研究所, 农业部饲料生物技术重点开放实验室, 北京 100081; 2. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072)

密码子优化提高aiiaB546毕赤酵母表达活性

张宇婷1曹雅男1解绶启2周志刚1

(1. 中国农业科学院饲料研究所, 农业部饲料生物技术重点开放实验室, 北京 100081; 2. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072)

N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)的蛋白水解酶, 通过水解AHLs生成酰基高丝氨酸, 使AHLs失去活性, 从而阻断病原菌的群体感应路径, 使病原菌失去致病能力, 其广泛存在于多种微生物中[1,2]。近年来N-酰基高丝氨酸内酯酶作为一种新型抗菌策略(群体感应淬灭策略)的工具酶而成为水产养殖防治细菌性疾病研究的热点[3—5]。

本研究室陈瑞东等在毕赤酵母中成功表达了Bacillus sp. B546来源的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiaB546),得到的重组酶具有良好的pH适性和稳定性以及抗大多数金属离子和蛋白酶的能力, 适合水产养殖条件, 经3.7 L发酵罐高密度发酵, 其表达量大幅提升, 使低成本获得大量的AiiaB546成为可能, 并且以酶制剂的形式通过活体注射的方式成功衰减了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila ATCC 7966)在锦鲤(Cyprinus carpio)中的致死能力。根据所知, 这是首次在毕赤酵母中高效表达N-酰基高丝氨酸内酯酶并通过注射该酶衰减嗜水气单胞菌的毒力。因此本实验具有潜在的抗菌策略探讨及水产养殖应用的价值, 但为了大量获得廉价可商业化的N-酰基高丝氨酸内酯酶, 进一步提高生物反应器的表达酶活显得尤为必要。

由于遗传密码具有简并性, 一种氨基酸可以有1—6个使用频率不同的同义密码子。对于特定的物种, 高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子, 这些密码子被认为是该物种高表达基因的优越密码子, 这种现象称为密码子偏爱性。密码子的偏爱性使得克隆的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母中获得高效表达的外源基因往往都是酵母偏爱密码子所编码的基因, 通过对酵母基因使用密码子的统计分析证实所有的61个密码子中有25个是酵母所偏爱的, 因此对密码子进行偏爱性改造能大量提高重组蛋白在该系统中的表达量[6]。

本研究旨在尝试通过密码子优化提高N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiaB546在毕赤酵母中的表达活性。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株

大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α购自北京全式金生物技术有限公司, 表达菌株毕赤酵母GS115和表达载体pPIC9购自Invitrogen公司, KYC55指示菌为本实验室保存。

1.2 其他材料

方格纸：边长为18 cm的正方形纸上排列22个长方形, 每个长方形的长为15个小方格, 宽为2个小方格, 每个小方格为边长4 mm。

ATmm盐溶液：KH2PO40.079 mol/L, NaOH 0.044 mol/L, (NH4)2SO40.015 mol/L, MgSO4·7H2O 0.6mmol/L, CaCl20.06 mmol/L, FeSO4·7H2O 0.027 mmol/L, MnSO4·H2O 0.007 mmol/L。

ATmm固体培养基：葡萄糖0.75 g,琼脂粉3 g,超纯水138 g,灭菌冷却后加入ATmm盐溶液15 mL, X-gal溶液200 µL。

3-oxo-C8-HSL购自Sigma公司, 内切酶均购自TaKaRa公司, T4连接酶为NEB公司产品。

1.3 基因aiiaB546M的设计改造及全合成

根据酵母密码子偏好性[6], 对高丝氨酸内酯酶成熟肽段的编码序列进行密码子优化, 并且使GC含量保持适中。优化后的序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全合成, 并与pUC57载体连接。

1.4 aiiaB546M- pPIC9表达载体的构建

小量提取质粒aiiaB546M-pUC57和质粒pPIC9, 用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切, 电泳后回收aiiaB546M连接到同样进行双酶切的空载体pPIC9中, 将连接后的质粒转化大肠杆菌DH5α, AOX通用引物验证、测序、获得重组载体aiiaB546M-pPIC9, 经BglⅡ酶切后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞, 涂布MD平板。

1.5 目的基因在毕赤酵母中的高效表达

挑取200个单克隆接种于3 mLBMGY培养液中, 30℃振荡培养48h; 3250 r/min离心5min去上清, 加入1 mLBMMY培养液诱导48h。将培养液10000 r/m离心5min, 收集上清液, 检测N-酰基高丝氨酸内酯酶活性,选择有活性的菌株进行菌落PCR验证, 正确后筛选酶活最高的阳性重组子。

1.6 阳性重组子中N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的检测

按照参考文献[4], 采用琼脂平板扩散法检测N-酰基高丝氨酸内酯酶活力, 取20 μL蛋白液加入179 μL 0.1 mol/L的PBS缓冲液(pH8.0)和1μL 1mg/mL的3-oxo-C8-HSL混合摇匀, 30℃温育30min后, 加入50 μL 10% SDS水溶液终止反应得到反应液, 对照液为反应终止后再加入20 μL热灭活酶液。取10 μL反应液(对照液)滴至胶条上, 30℃培养24h后计数变蓝点数, 计算距离, 按酶活计算公式计算待测溶液的酶活。

1.7 密码子优化前后表达水平及酶活力的比较

按照1.5所述的方法, 将未进行密码子优化的原基因aiiaB546连接pPIC9载体后, 转化毕赤酵母GS115感受态细胞, 挑取200个单克隆, 诱导后选择酶活最高的菌株为对照, 与改造后的重组菌株在相同条件(接种量、培养及诱导时间、仪器设备)下进行诱导表达, 通过考马斯亮蓝法测定两组样品酶液中的蛋白含量, 比较二者的酶活力, 重复三次取平均值。SPSS 11.0软件进行ANOVA方差分析, 显著性临界值设定0.05。

2 结果

2.1 aiiaB546M基因的全合成

aiiaB546M基因成熟肽编码序列全长753 bp, 密码子优化时, 在氨基酸序列保持不变的前提下, 共改变了155个碱基, GC含量由45.18%下降到41.38%, 基本符合毕赤酵母GC含量特征[6](图1)。基因合成后克隆到载体pUC57上, 得到重组质粒aiiaB546M-pUC57。

2.2 含aiiaB546M基因的重组表达载体的构建

载体pPIC9和重组质粒aiiaB546M-pUC57都用EcoRⅠ和Not Ⅰ双酶切(图2), 回收后连接, 得到重组毕赤酵母表达载体aiiaB546M- pPIC9。

2.3 表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的重组毕赤酵母菌株的

筛选

aiiaB546M- pPIC9经BglII酶切后, 电击转化毕赤酵母GS115菌株, 按1.5和1.6所述方法筛选得到高效表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的重组毕赤酵母GS115-aiiaB546M,每个重组菌株设两个平行(图3)。

2.4 密码子优化前后蛋白浓度及酶活力的比较

经测定, 密码子优化前后N-酰基高丝氨酸内酯酶的蛋白浓度分别为1.37 mg/mL和1.54 mg/mL, 酶活力分别为33.1 U/mL和36.2 U/mL, 可以看出经密码子优化后,蛋白表达量提高了12.4% (*P<0.05), 酶活性提高了9.5% (*P<0.05)。

3 讨论

高效表达N-酰基高丝氨酸内酯酶是进一步提高该酶发酵效价、降低生产成本的新的有效途径。来源于Bacillus的AiiaB546是迄今所报道的首次可以在毕赤酵母中表达的N-酰基高丝氨酸内酯酶, 且具有很好的热稳定性、金属离子抗性及抗蛋白酶降解能力, 经毕赤酵母表达的该酶和嗜水气单胞菌共注射锦鲤可以较明显地降低锦鲤死亡率和延迟半数致死时间, 而只注射该N-酰基高丝氨酸内酯酶对锦鲤无害[3]。在水产养殖防治嗜水气单胞菌引起的疾病中, 注射或潜在的饲喂N-酰基高丝氨酸内酯酶可能成为一种替代抗生素的方法[7]。本文将aiiaB546基因进行改造后在毕赤酵母中实现了高效表达, 摇瓶诱导条件下的最高酶活力达到36.2 U/mL, 而相同条件下原基因(aiiaB546)重组质粒aiiaB546-pPIC9转化毕赤酵母GS115重组菌的酶活力为33.1 U/mL, 显然经密码子优化后, 该酶在摇瓶水平的表达活性有了明显提高, 但仍需进行小试及中试发酵水平的验证以确认此改善幅度的实际价值。

图1 密码子优化前后基因的比对Fig. 1 The gene before and after codon optimization

图2 双酶切后的aiiaB546M基因和pPIC9载体Fig. 2 The gene aiiaB546M and vector pPIC9 after digestion with EcoRI and NotI

根据表达宿主的密码子偏爱性对外源基因的密码子进行优化, 是提高外源基因表达量的一种有效方法[8,9], 毕赤酵母表达系统在密码子使用上的偏爱性在翻译水平影响外源基因的表达, 尤其是稀有密码子密集区往往成为制约翻译速率及表达水平的因素。本研究将aiiaB546基因中所有低偏爱性密码子及大部分中等偏爱性密码子替换为高偏爱性密码子, 使其在毕赤酵母中的表达量与活性分别较优化前提高了12.4%和9.53%。

图3 重组毕赤酵母GS115-aiiaB546M高酶活菌株的筛选Fig. 3 Screen of recombinant GS115-aiiaB546Mstrain with high enzyme activity

另外, 增加外源基因在毕赤酵母染色体上整合的拷贝数也是提高外源蛋白表达量的有效方式[10], 本研究室正在对N-酰基高丝氨酸内酯酶进行这方面的尝试。

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THE N-ACYL-HOMOSERINELACTONASE-XYLANASEGENE AIIAB546 REACHED A HIGHER EXPRESSION LEVEL BY CODON OPITIMIZATION IN PICHIAPASTORIS

ZHANG Yu-Ting1, CAO Ya-Nan1, XIE Shou-Qi2and ZHOU Zhi-Gang1
(1. Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, State Key Laboratory for Freshwater Ecology and Biotechnology, Wuhan 430072, China)

N-酰基高丝氨酸内酯酶; 密码子优化; 酵母表达

N-acyl-homoserinelactonase; Codon optimization; Yeast expression

Q786

A

1000-3207(2013)01-0164-04

10.7541/2013.164

2011-12-20;

2012-11-01

十二五国家科技支撑计划项目(2012BAD25B00); 天津市农业科技成果转化与推广项目(201004040); 北京市鲟鱼、鲑鳟鱼产业技术体系; 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室开放基金(2011FB05)资助

张宇婷(1986—), 女, 内蒙古呼和浩特人; 硕士研究生; 主要从事水产微生物基因工程研究。E-mail: zhangyt_1986@ sina.com

周志刚, E-mail: zhou_zg@msn.com