电感耦合等离子体发射光谱法测定尿铜的评价

张宪伟，徐静茹，曹波

(南京医科大学附属南京儿童医院，江苏南京 210008)

肝豆状核变性又称Wilson病(WD)是目前少数可治疗的遗传代谢性疾病之一，其诊断主要依赖于实验室检查，尿铜是最常用的诊断指标之一[1-3]。尿液中的铜元素因含量低，基本成分复杂，个体差异较大，测定方法在灵敏度、准确度、抗干扰力和稳定性等方面要求较高。目前国内尿铜检测方法主要是采用原子吸收分光光度计火焰法(AAS)，该方法仪器简单，线性范围窄，重现性较差，受外界干扰因素影响大。本研究基于电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)具有较高的精密度与准确度，符合实验室尿铜检测标准化的需求。

1 材料方法

1.1 标本

尿液标本:来自南京市儿童医院检验科，采用浓硝酸5 ml防腐，收集3个不同尿铜浓度标本(2009-1N、2009-2N、2009-3N)24 h尿量，留取30 ml尿液样本待检。尿液标本外观清亮，尿常规检测结果正常，除外黄疸尿、乳糜尿等异常样本，同时收集我院就诊的100名体检儿童尿液作为正常对照。

1.2 仪器及实验器材

1.2.1 仪器 法国JY公司ULTIMA-2型电感耦合等离子体原子发射光谱仪，按仪器操作规程进行检测。

1.2.2 实验器材 所有与试剂、水、稀释液或样本接触的玻璃或塑料器材按下列步骤清洗:(1)使用常规清洗程序(含去污剂热水浸泡，自来水冲洗);(2)在30%硝酸中浸泡过夜;(3)去离子水冲洗5～10 min;(4)无尘环境中倒置自然干燥。

实验条件:环境温度20～25℃，湿度20%～50%，电压波动＜5%，氩气纯度99%，循环冷却水温23℃。仪器高频发生器频率40.68 MHz，高频输出功率0.95 kW，反射功率 ＜5 W，载气流量1.0 L·min－1，等离子气流量 12 L·min－1，护套气流量 0.2 L·min－1，提升量 1 ml·min－1，输入狭缝 20，输出狭缝 15，观测高度 10 mm，积分时间 5 s[4]。

Milli-Q净化水装置:密里博中国有限公司生产。用于实验室去离子水制备。去离子水:(≥15 MΩ·cm－1)，供试剂配制和器皿冲洗。

DRAGON-MED移液器:南京市计量局每年1次强检，厂家每年校准1次，每月1次内校正。

1.3 试剂

美国SPEX公司，铜元素标准液。质控品:美国SPEX公司，多元素质控物。浓硝酸:南京化学二厂，优级纯。

1.4 AES尿铜检测操作程序

(1)择铜的检测共振线324.754 nm，保证仪器稳定，重复检测同一空白液发射光强度，保证相对偏差(RSD)＜2。

(2)测定0、10、20、50、100 μg·L－1质量浓度的铜标准液，仪器自动绘制标准曲线，并对空白液进行20次测定，仪器自动计算检出限。

(3)质控样品分析，样本重复3次，RSD＜2，取均值。

(4)尿液样本分析，尿液标本用去离子水稀释5倍，每份样本重复测定3次，RSD＜2，取均值;每检测5份样本，插入1份质控样本，并保证整个检测过程中质控样本变异RSD＜2。

2 结 果

2.1 精密度

将分装好的2009-1N、2009-2N、2009-3N尿液标本，每日取出1瓶测定，每瓶为1批，各检测6批，每批标本重复检测3次，计算批内CV、批间CV和总CV。结果见表1。

表1 ICP-AES测定尿铜的精密度

2.2 回收率

取1份体检尿液标本，分装5管，每管5 ml，其中1管做空白，另4管分别加入铜质量浓度为62.5、125、250、500 μg·L－1的标准品，测定其回收率。见表 2。

表2 ICP-AES测定尿铜的回收率

2.3 灵敏度检测

检测灵敏度是标准曲线的斜率。以发射光强度为Y，浓度为X，回归方程Y=25 385X+16 577，r=0.999 8。见图1。

图1 尿铜的标准曲线

2.4 检出限测定

测量空白液20次的发射光强度，仪器会自动计算出样品的最低检出限0.004 2 μg·L－1。根据测量空白液20次的发射光强度的标准差的3倍所对应的样品浓度为检测限的原则[5]。

2.5 干扰实验

标本收集时，采用5 ml浓硝酸作为尿液防腐剂。为了检测浓硝酸对尿铜检测的影响，分别定容50 ml的 500、1 000、2 000 μg·L－1的质控液中加入浓硝酸1.25 ml，检测加入硝酸与未加硝酸质控液中铜的含量，见表3。

表3 浓硝酸干扰试验尿铜检测结果

实验结果显示，加入浓硝酸前后铜元素含量改变不明显。

因为ICP-AES分辨率可达0.01 nm，尿中的低浓度元素不会对铜的测定产生干扰。采用尿中浓度较高的钾、钠、氯进行干扰实验，即在水空白溶液中按1∶1分别加入25 mg·L－1钾、钠、氯的标准品溶液，测定铜含量，实验结果显示空白溶液中加入干扰元素后，未检测出铜含量的明显变化。

2.6 儿童尿铜参考值范围

检测我院就诊100名体检儿童尿液铜，正常值范围(36.42 ±6.78)μg·L－1。见表4。

表4 100名健康体检儿童尿铜含量

3 讨 论

临床对尿铜测定结果的准确度与精密度要求较高。尿铜检测首先要考虑的是结果的可靠性，其次考虑自动化、高效性、样本微量化等因素[6]，批间精密度≤8%。ICP-AES检测3个不同水平的尿液标本，批间精密度≤5%，满足建立测量程序的要求。

影响ICP-AES准确度和精密度的因素很多，主要有定标溶液的准确性、仪器及环境的稳定状态等。在标准液配制过程中严格遵守操作规程，避免容量瓶等实验器材和水的污染，保证操作环境稳定。有实验表明，储存超过3 d的空白液，其发射光和吸光强度都会明显增加[7]，所以空白工作液和定标液均现配现用，以减少试剂对实验的影响。

实验结果显示，浓硝酸作为尿液标本的防腐剂，对检测结果无影响。有实验证实，绝大多数阴离子，如硝酸、草酸等酸根离子对尿铜的影响不大。本实验中发现，部分尿液标本中由于含较高浓度的钠离子和氯离子，高温下会在炬芯内壁上形成大量固体晶体，导致仪器的火炬熄灭，所以我们采用去离子水稀释尿液标本检测。经实验证实，对尿液标本以 1∶2、1∶5、1∶10 的稀释对检测结果的影响甚微，考虑到检测样本的系检测的吸样量和发射光量，选择1∶5作为尿液稀释的倍数，故本实验采用直接稀释法检测。

ICP-AES对检测环境要求较高，主要包括电压、温度、氩气纯度、排风、湿度、循环冷却水温等。温度和湿度对其检测结果影响较大，环境温度 ＞30℃及湿度＞80%，检测峰会出现明显漂移。此外，循环水温＞30℃亦会明显影响发生器功率的稳定，使得定标结果和检测结果出现漂移(＞2 RSD)。检测前，仪器点火成功后应稳定半小时以上，输出功率稳定在1.0 kW，反射功率＜5 W。

ICP-AES测定尿铜的方法具有准确度高、精密度高、检出限低、费用低的优点。同时，实验不需要常规的消化处理设备，减少了试剂的用量和预处理的时间，因此建议作为临床测定尿铜的常规检测方法。

[1]ALA A，SCHILSKY M L.Wilson disease:pathophysiology diagnosis treatment and screening[J].Clin Liver Dis，2004，8:787-805.

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[5]International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC):Analitical Chemistry Division.Nomenclature，symbols，units and their usage in spectrochemical analysis-V radiation sources[J].Pure Appl Chem，1981，19(6):395-412.

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[7]马怀安，王清涛，王金英，等.血清钙测量参考方法的复现及方法学评价[J].中华检验医学杂志，2009，32(5):526-530.