川芎嗪对IgA肾病大鼠模型足细胞的保护作用和作用机制

林小春 叶晓华 林瑞霞 杨青 陈敏广

川芎嗪对IgA肾病大鼠模型足细胞的保护作用和作用机制

林小春 叶晓华 林瑞霞 杨青 陈敏广

目的 研究川芎嗪对IgA肾病（IgAN）大鼠模型足细胞的保护作用和作用机制。 方法 建立IgAN大鼠模型，按照体重匹配原则分成正常组（A组）8只、模型组（B组）12只、地塞米松组（C组）12只、川芎嗪组（D组）12只。使用生化分析仪测定24h尿蛋白，电镜观察足细胞形态，RT-PCR检测肾组织Nephrin mRNA的表达水平。 结果 B、C、D组在造模成功后第4周末均出现蛋白尿，第4、8、10、12周末时24h尿蛋白总量均高于A组，偶见肉眼血尿，差异均有统计学意义（均P＜0．01），但3组间的差异无统计学意义（P＞0．05）；在第14、16周末时，C、D组24h尿蛋白总量明显低于B组（P＜0．01）。电镜下见A组足突形态正常,排列整齐，B组多数肾小球足突部分融合，C组和D组足突极少部分融合。RT-PCR检测结果C、D组Nephrin mRNA表达水平较B组高，差异有统计学意义（P＜0．01）。结论 川芎嗪能降低IgAN大鼠的24h尿蛋白总量，减少足突的融合；Nephrin在IgAN大鼠模型损伤中起重要作用，川芎嗪能增加肾组织Nephrin mRNA的表达水平。

川芎嗪 IgA肾病 足细胞 Nephrin 大鼠

IgA肾病（IgA nephropathy，IgAN）是我国最常见的原发性肾小球疾病，约占肾活检病例的1/3，是一类临床表现多样，以肾小球系膜区IgA为主要免疫复合物颗粒样沉积、系膜细胞和系膜基质增多为特征的肾小球疾病。患者在诊断IgAN后10年内（约20%）或20年内（约36%）进入终末期肾功能衰竭[1-2]，然而目前仍无有效的治疗方法。近年来发现IgAN与足细胞病变密切相关，其中Nephrin是足突特异性表达蛋白、维持肾小球滤过膜结构和功能完整性的重要蛋白之一[3]。Gagliardini等[4]发现IgAN的足细胞的Nephrin、Podocin、Podoplaninm表达减少。川芎嗪（tetramethlpyrazine）是从川芎根茎中提取分离的生物碱单体，临床发现其具有降低蛋白尿水平、减轻足细胞损伤的功能，是防治慢性肾功能衰竭、膜性肾病、紫癜性肾炎、狼疮肾炎等肾脏疾病非常有前景的一种中药[5-8]，因此，笔者将川芎嗪用于患有IgAN的大鼠模型，研究其对足细胞的保护作用和作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 选取44只清洁级SD雌性大鼠，体重154～170g，平均（163.000±4.503）g。经尿常规检查无异常后，按照配对（体重基本相同）比较法分成4组，正常组（A组）8只，体重155～170g，平均（162.630±5.344）g；模型组（B组）12只，体重154～170g，平均（163.000±4.553）g；地塞米松组（C组）12只，体重154～170g，平均（162.830± 4.345）g；川芎嗪组（D组）12只，体重154～170g，平均（163.420±4.602）g。主要试剂：牛血清白蛋白（Amresco公司，BSA），脂多糖（Sigma公司），四氯化碳（南京化工有限公司），FITC标记的小鼠抗大鼠IgA（Secrotec公司），注射用川芎嗪针（哈尔滨三联药业有限公司），注射用地塞米松针（安徽丰原药业有限公司）。

1.2 方法 模型的制作参照刘志红、汤颖等[9-10]使用的方法。操作步骤：将所有大鼠于实验第1天起隔日灌服BSA400mg/kg（0.9%氯化钠溶液稀释成浓度为50mg/ml的溶液），持续8周；第6周起予BSA 20mg/kg（0.9%氯化钠溶液稀释成浓度为25mg/ml的注射液）尾静脉注射，1次/周，连续3周；第6、8周时在尾静脉分别注射0.3mg/ kg脂多糖（0.9%氯化钠溶液稀释成浓度为0.25mg/ml的注射液）1次。第1周起皮下注射四氯化碳0.1ml，并与蓖麻油0.4ml混合，每周1次，持续10周，观察至第12周末。A组以等量的0.9%氯化钠溶液代替造模使用的药物。给药方法：第12周起C组予地塞米松针2.5mg/kg腹腔注射，1次/d，D组予川芎嗪针80mg/kg腹腔注射，1次/d，A、B组予等量0.9%氯化钠溶液腹腔注射，1次/d，持续4周。

1.3 动物标本的留取 各组实验大鼠分别在造模后第4、8、10、12、14、16周末用代谢笼收集24h尿液；实验结束后禁食12h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，沿腹中线剖开取肾脏，一块肾组织保存于40g/L多聚甲醛液中，用于常规光镜检测；一块肾组织立即用0.9%氯化钠溶液纱布包裹，以免干涸，用于冰冻切片行免疫荧光检测；一块肾组织直接放入液氮中用于RT-PCR检查；同时切取约1mm3肾皮质以2.5%戊二醛加2%多聚甲醛混合液固定后用于电镜检查。

1.4 监测指标 采用全自动生化分析仪检测第4、8、10、12、14、16周末24h尿蛋白总量，直接免疫荧光法测定IgA沉积强度；HE和PAS染色观察肾组织病理改变；电镜下观察足细胞形态变化。RT-PCR检测肾组织Nephrin mRNA的表达水平，采用GelPro31分析软件计算Nephrin、GAPDH电泳条带的光密度（IOD）值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以表示，组间及组内比较采用方差分析。

2 结果

2.1 4组大鼠24h尿蛋白总量的变化 见表1。

表1 4组大鼠24h尿蛋白总量的变化（mg）

由表1可见，实验过程中，A组未出现大鼠死亡，B组死亡4只分别在第12、15、16周，C、D组死亡各2只，均在第12周。B、C、D组在造模成功后第4周末均出现蛋白尿，第4、8、10、12周末时24h尿蛋白总量均高于A组，偶见肉眼血尿，差异均有统计学意义（均P＜0.01），但3组间的差异无统计学意义（P＞0.05）；在第14、16周末时，C、D组24h尿蛋白总量明显低于B组（P＜0.01），与D组比较，C组对蛋白尿的改善作用明显（P＜0.01）。2.2 4组肾组织免疫荧光IgA沉积 A组大鼠肾小球IgA沉积呈阴性反应；B组大鼠肾组织均发现肾小球系膜区有较强的颗粒状IgA沉积；C、D组有不同程度的IgA沉积，但沉积程度较B组轻，其中C组最轻，部分不能清晰显示（图1）。4组间荧光灰度值的差异有统计学意义（P＜0.01），详见表2。

表2 4组大鼠IgA免疫荧光平均灰度值

图1 4组大鼠IgA免疫荧光检测比较（A：A组阴性；B：B组肾小球系膜区有较强的颗粒状IgA沉积；C：C组沉积程度较B组轻；D：D组沉积程度较B组轻，但较C组明显；×400）

2.3 4组肾组织的光镜和电镜观察结果 光镜：A组肾小球体积正常，系膜区细胞无明显增生，系膜基质未见增加，毛细血管袢开放良好；B组肾小球体积增大，系膜细胞和系膜基质中度增生，系膜区明显增宽，肾间质可见淋巴细胞浸润；C、D组大鼠肾小球体积均轻度增大，系膜细胞及基质以轻度增生为主，D组有少许中度增生，系膜区增宽不明显，少见新月体形成和硬化，肾间质有少数淋巴细胞浸润，其中C组改善更明显。肾小球细胞计数：A组（44.13±3.16）个/肾小球，B组（65.31±4.61）个/肾小球，C组（47.43±5.50）个/肾小球，D组（55.42±6.74）个/肾小球，各组间的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。电镜：A组足突形态正常，排列整齐；B组多数肾小球足突部分融合；C组和D组足突极少部分融合，其中C组更为明显，详见图2、3。

图2 4组肾组织光镜病理切片比较（A：A组结构正常；B：B组系膜细胞及基质中度增生；C：C组系膜细胞及基质轻度增生；D：D组系膜细胞及基质轻-中度增生；HE染色，×400）

图3 4组肾组织电镜足细胞比较（A：A组足突形态正常；B：B组足突部分融合、脱落；C：C组足突极少部分有融合；D：D组足突少许部分融合；×15 000）

2.4 4组大鼠肾组织Nephrin mRNA表达情况 C、D组肾组织中的Nephrin mRNA表达水平较B组升高（P＜0.01），且C组表达水平比D组高（P＜O.01），详见表3、图4。

表3 4组大鼠肾组织Nephrin mRNA表达情况

3 讨论

图4 第16周末4组大鼠组织Nephrin mRNA的表达

IgAN临床表现多样、病理改变复杂，迄今尚未完全阐明其确切的发病机制，目前临床上缺乏特异性的治疗措施，因此对本病的相关研究具有积极的临床意义。目前IgAN仍无有效的治疗方案，糖皮质激素是最重要、最常用的抗炎药物，但糖皮质激素在针对病理变化较重、糖皮质激素抵抗或使用激素不良反应明显的IgAN患者的治疗中仍存在盲点。因此，有必要为IgAN患者寻求一种新的有效药物或者联合治疗，减少激素的不良反应。

川芎嗪是从川芎根茎中提取分离的生物碱单体，临床应用已表明川芎嗪有降低蛋白尿水平，减少免疫复合物沉积，减轻足细胞损伤，是防治慢性肾功能衰竭、膜性肾病、紫癜性肾炎、狼疮肾炎等肾脏疾病非常有前景的一种中药。张明霞[11]关于川芎嗪治疗原发性肾病患者（其中IgAN 3例）的研究表明，川芎嗪可减轻肾小球病理损伤，减少尿蛋白量，保护肾功能，但IgAN例数较少。有文献表明，蛋白尿一方面能反映肾小球损伤，另一方面是导致慢性肾脏病变的独立危险因素，临床上备受关注[12]。这是由于大量蛋白尿会引起肾小球三高（高灌注、高滤过、高囊内压），最终导致肾小球硬化以及肾间质的纤维化。本实验动态观察了各实验组的蛋白尿情况，发现川芎嗪可以降低IgAN模型大鼠的蛋白尿。

足细胞与IgAN关系密切。Lemeley等[13]发现IgAN患者足细胞数目的缺失程度与其病情进展密切相关，它与临床蛋白尿的增加、肾功能的下降及病理肾小球的硬化程度密切相关，提示足细胞缺失可能是IgAN病情加重的征兆。Hishikit等[14]则在IgAN患者肾组织光镜和电镜下观察其病理变化，发现足细胞损伤是预测IgAN预后不良的高敏感指标之一，其中Nephrin是足突特异性表达蛋白,是维持肾小球滤过膜结构和功能完整性的重要蛋白之一[3]。Nephrin为跨膜蛋白并在裂孔膜上特异表达，Podocin通过其C末端与Nephrin相互作用，可促进Nephrin诱导的信号传导。研究表明，Nephrin、Podocin信号传导异常会引起足细胞功能异常并且导致蛋白尿的发生[15]。本实验发现IgAN肾组织足突部分的融合，Nephrin表达的减少，蛋白尿的增多，C、D组Nephrin的表达较B组表达明显上升，足细胞融合较B组减少，可能为其治疗IgAN的另一种机制。

本实验虽然成功复制了IgAN的肾脏病理改变以及炎症发生过程，但仍为一种继发性的IgAN模型，肾组织新月体形成等纤维化、硬化表现少见，与临床以低糖基化理论为核心的IgAN发病过程尚有一定的差别。此外，本研究在川芎嗪注射治疗阶段中无一例大鼠死亡，可见其不良反应小，但未监测相关指标，尚需要完善。虽然川芎嗪具有降低蛋白尿、抑制炎症反应和改善足细胞融合等重要作用已在本研究中得到充分体现，但川芎嗪类药物对IgAN的临床治疗意义还需要更多的实验论证。

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Protective effects of tetramethylpyrazine on podocytes of rats with IgA nephropathy

Objective To investigate the effects of tetramethylpyrazine (TMP)on podocytes of rats with IgA nephropathy．Methods Female Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into 4 groups:control group(group A,n=8),IgA nephropathy model group(group B,n=12),dexamethasone(DXM)group（group C,n=12）and TMP group(group D,n=12)．IgA nephropathy was induced in groups B,C,D,DXM and TMP were given to groups C and D respectively．The 24h-urine protein was determined with a automatic biochemistry analyzer;the morphology of podocyte was observed with transmission electron microscope;and the expression of Nephrin mRNA was detected by RT-PCR．Results Proteinuria was presented in group B,C and D from week 4,the quantity of 24h urinary protein was all higher than that in group A(P＜0．01);but the quantity in group C and D was significantly lower than that in group B in week 14 and 16 (P＜0．01)．Electron microscopy showed that most glomerular foot processes were fused in group B,but only few in group C and D．The expression of Nephrin mRNA in renal tissue of group C and group D was significantly higher than that of group B(P＜0．01)．Conclusion Like dexamethasone,TMP can reduce 24h-urinary protein excretion and improve foot process fusion in rat IgA nephropathy,which is associate with up-regulation of Nephrin mRNA in renal tissue．

Tetramethlpyrazine IgA nephropathy Podocyte Nephrin Rat

2012-10-23）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省中医药科学研究基金（2009CB056、2011ZA076）作者单位：325027 温州医学院附属育英儿童医院肾内科

林瑞霞，E-mail:dd-byx@163.com