局部注射酸敏感离子通道抑制剂阿米洛利对胫骨癌痛大鼠疼痛行为学的影响

胡四平 汪卫星 刘洋 吴鹤芬 余亮 刘鹤 王翔

局部注射酸敏感离子通道抑制剂阿米洛利对胫骨癌痛大鼠疼痛行为学的影响

胡四平 汪卫星 刘洋 吴鹤芬 余亮 刘鹤 王翔

目的 观察局部注射酸敏感离子通道抑制剂阿米洛利对胫骨癌痛的缓解作用。 方法 选取32只雌性SD大鼠，按随机数字表法分为4组，空白对照组（Cont组）、假手术组（Sham组）、骨癌痛组（BCP组）和骨癌痛联合阿米洛利组（A组），各8只。BCP组和A组大鼠在胫骨上端骨髓腔内注射5μl Walker-256乳腺癌细胞制备胫骨癌痛模型，建模成功后第7天于胫骨上端区分别注射0．9%氯化钠溶液和阿米洛利溶液各100μl；Sham组大鼠胫骨上端骨髓腔内注射等体积Hank液，并于相同时间点在胫骨上端区注射0．9%氯化钠溶液100μl。分别于注射Walker-256乳腺癌细胞或Hank液前1天（T0）、注射后第7天（T1）、注射阿米洛利或0．9%氯化钠溶液后30min（T2）、1 h（T3）、2 h（T4）、4 h（T5）、8 h（T6）时检测各组大鼠机械缩足阈值（MWT）和自由行走疼痛评分。 结果 与T0比较，BCP组和A组各时点MWT值、自由行走疼痛评分的差异有统计学意义（P＜0．05）；与Cont组相比，BCP组和A组各时点MWT值、自由行走疼痛评分的差异有统计学意义（P＜0．05）；与BCP组比较，A组T2～T5MWT值、自由行走疼痛评分的差异有统计学意义（P＜0．05）；与T1时比较，A组T2～T5MWT值、自由行走疼痛评分的差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 局部注射酸敏感离子通道抑制剂阿米洛利可有效缓解胫骨癌痛大鼠的疼痛行为。

骨肿瘤 疼痛 阿米洛利

既往研究发现肿瘤组织参与疼痛的进展，其分子机 制十分复杂且不明确[1]。最近研究发现，初级感觉神经元上的酸敏感离子通道（acid sensing ion channels，ASICs）可由癌症骨转移形成的酸性微环境激活产生疼痛信号[2]。阿米洛利（amiloride）作为ASICs的非选择性抑制剂，可以明显缓解急性和慢性炎性疼痛[3-4]，但其对癌痛的影响尚未见报道。本实验利用大鼠胫骨癌痛模型，观察局部注射阿米洛利对骨癌痛大鼠疼痛行为学的影响，为临床骨癌痛的治疗提供新思路和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠32只，体重160～180 g，由浙江大学实验动物中心提供。实验前所有大鼠静养适应1周，昼夜交替照明（8∶00～20∶00），室温21～25℃，湿度40%～60%，自由摄食、饮水。Walker-256肿瘤细胞（中国上海生物医学工程研究所），Von Frey纤丝（美国Stoelting公司），阿米洛利（美国Sigma公司）。

1.2 方法 按随机数字表法分成4组，空白对照组（Cont组）、假手术组（Sham组）、骨癌痛组（BCP组）和骨癌痛联合阿米洛利组（A组），每组各8只。BCP组和A组大鼠参照文献[5]方法制备胫骨癌痛模型，采用体外培养Walker-256乳腺癌细胞，密度为2×107/ml。10%水合氯醛0.4ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，右侧后肢剪毛、消毒皮肤，切开皮肤暴露胫骨上端，针尖在胫骨干骺端穿刺打孔后，微量注射器刺入骨髓腔缓慢注射5μl Walker-256乳腺癌细胞的培养液，注射后骨蜡迅速封堵针孔并涂抹医用胶水，消毒后组层缝合切口，局部涂抹红霉素眼膏预防感染。Sham组大鼠右侧胫骨注射等体积Hank液，其余操作同上。建模成功后第7天BCP组与A组于胫骨上端分别注射0.9%氯化钠溶液和阿米洛利溶液100μl，Sham组注射0.9%氯化钠溶液100μl，Cont组不做任何处理。

1.3 机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）测定 将有机玻璃箱置于铁丝网格上，大鼠置于有机玻璃盒预适应30min，以不同力度的Von Frey纤毛刺激大鼠足底，按照升序从1g开始，最大刺激力度为26g。以纤毛稍稍弯曲作为完全受力标准，持续刺激5s，连续5次，每次至少间隔30s，大鼠出现抬足或舔足行为为阳性反应。若3次不抬腿，换高一级克数的纤毛；有3次抬腿，则返回低一级克数的纤毛，直到每5次测试中有3次抬腿。5次中能够引起3次抬腿的最低Von Frey纤毛克数计为MWT值。分别于注射Walker-256乳腺癌细胞或Hank液前1天（T0）、注射后第7天（T1）、注射阿米洛利或0.9%氯化钠溶液后30min（T2）、1h（T3）、2h（T4）、4h（T5）、8h（T6）时测定各组大鼠MWT值。

1.4 自由行走疼痛评分 参照文献[5]评分标准观察大鼠自由行走疼痛行为：0分，大鼠行走正常；1分，造模侧后肢使用正常，轻度跛行；2分，介于1分和3分之间；3分，造模侧后肢严重跛行；4分，造模侧后肢不能着地。1.5 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件。计量资料以表示，组内比较采用重复测量方差分析，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 4组大鼠MWT值的比较 与T0比较，BCP组和A组各时间点MWT值较低，差异有统计学意义（P＜0.05），Cont组和Sham组各时点间MWT值的差异无统计学意义（P＞0.05）；与Cont组相比，BCP组和A组各时间点MWT值明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），而Sham组各时间点MWT值无明显差异（P＞0.05）；与BCP组比较，A组T2～T5MWT值较高，差异有统计学意义（P＜0.05），T1时无明显差异（P＞0.05））；与T1比较，A组T2～T5MWT值升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 各组大鼠不同时点MWT比较（与T0比较，*P＜0.05；与Cont组比较，#P＜0.05；与BCP组比较，§P＜0.05；与T1时比较，△P＜0.05）

2.2 各组大鼠自由行走疼痛评分比较 与T0比较，BCP组和A组各时点自由行走疼痛评分较高，差异有统计学意义（P＜0.05），Cont组和Sham组各时点间自由行走疼痛评分的差异无统计学意义（P＞0.05）；与Cont组相比，BCP组和A组各时点自由行走疼痛评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05），Sham组各时点自由行走疼痛评分差异无统计学意义（P＞0.05）；与BCP组比较，A组T2～T5自由行走疼痛评分降低，差异有统计学意义（P＜0.05），T1无明显差异（P＞0.05）；与T1时比较，A组T2～T5自由行走疼痛评分降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

3 讨论

癌症骨转移最常见的并发症是骨癌痛，既严重影响患者的生活质量又易引发其他并发症。“癌痛三阶梯疗法”是目前癌痛的主要治疗方法，但尚有不少患者得不到有效缓解。当患者为缓解疼痛而使用大剂量强效阿片类药物治疗时，极易引发严重的不良反应甚至危及生命。因而，寻求有效的药物和方法是临床癌痛治疗中关注的焦点。

图2 各组大鼠不同时间点自由行走疼痛评分比较（与T0比较，*P＜0.05；与Cont组比较，#P＜0.05；与BCP组比较，§P＜0.05；与T1时比较，△P＜0.05）

局部组织酸化是癌症骨转移过程中重要的病理生理过程，由转移的癌细胞、骨吸收的破骨细胞及炎症细胞等产生的大量质子而形成局部酸性微环境[6-8]。动物实验以及人类骨癌痛的研究发现，破骨细胞既是骨丧失中的重要角色，也参与骨癌痛形成：破骨细胞和肿瘤细胞均能释放H+维持骨肿瘤局部酸性微环境（pH 4.0～5.0），可能在骨癌痛产生过程具有重要作用[9]。ASICs作为质子受体，是一种质子门控阳离子通道，包括7个亚单位：ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4，主要表达在中枢和外周神经系统，其中ASIC1b和ASIC3大量表达在包括背根神经节在内的外周神经系统[10]。有研究发现，ASICs mRNA表达和活性可在炎症引起的酸性条件下增加，特别是ASIC3与降钙素基因相关肽阳性神经共表达在支配骨膜表面的感觉神经元上，提示ASICs在组织酸化引起的疼痛中发挥重要作用[11]。本研究发现：（1）MWT值：与T0比较，BCP组和A组各时间点自由行走疼痛评分较高；与Cont组相比，BCP组和A组各时间点自由行走疼痛评分升高。（2）自由行走疼痛评分：与T0比较，BCP组和A组各时间点自由行走疼痛评分较高；与Cont组相比，BCP组和A组各时间点自由行走疼痛评分升高。本研究结果与上述理论相符。因此，针对骨肿瘤局部酸性微环境和ASICs进行干预，可能成为骨癌痛治疗的有效靶点。

本研究发现，大鼠骨癌痛模型建立后第7天MWT值明显降低，与文献报道一致[12]，提示模型建立成功，故本研究选择模型建立后第7天注射阿米洛利检测各组大鼠MWT值变化是正确的。本研究结果显示：（1）MWT值：与BCP组比较，A组T2～T5MWT值较高；与T1时比较，A组T2～T5MWT值升高。（2）自由行走疼痛评分：与BCP组比较，A组T2～T5自由行走疼痛评分降低；与T1时比较，A组T2～T5自由行走疼痛评分降低。该结果表明使用ASICs的抑制剂阿米洛利可以明显抑制大鼠骨癌痛模型MWT值的降低及自由行走疼痛评分，其机制可能为阿米洛利抑制癌症局部ASICs活性，阻断ASICs下游信号通路，从而抑制外周疼痛信息向脊髓以上中枢传递，但目前本研究仅从行为学上初步证实阿米洛利对大鼠骨癌痛的治疗作用，其具体下游胞内信号通路和分子机制尚有待进一步探讨。

综上所述，局部注射阿米洛利可以有效缓解大鼠胫骨癌痛，为临床骨癌痛的治疗提供新思路和理论依据。

[1]Edrinton J,Sun A,Wang C,et al．Barriers to pain management in a community sample of Chinese American patients with cancer [J]．J Pain Symptom Manage,2009,37(4):665-675．

[2]Nakanishi M,Hata K,Yoneda T．Encounter of cancer cells with bone．Molecular mechanism of cancer-induced bone pain[J]．Clin Calcium,2011,21(3):357-363．

[3]Chu X P,Papasian C J,Wang J Q,et al．Modulation of acid-sensing ion channels:molecular mechanisms and therapeutic potential[J]．Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol,2011,3 (4):288-309．

[4]Andreev Y A,Vassilevski A A,Kozlov S A．Molecules to selectively target receptors for treatment of pain and neurogenic inflammation[J]．Recent Pat Inflamm AllergyDrug Discov,2012,6(1): 35-45．

[5]Luger N M,Sabino M A,Schwei M l,et al．Efficacy of systemic morphine suggests a fundamental difference in the mechanisms that generate bone cancer vs inflammatory pain[J]．Pain,2002, 99(3):397-406．

[6]Rousselle A V,Heyman D．Osteoclast acidification pathways during bone resorption[J]．Bone,2002,30(4):535-540．

[7]Griffiths J R．Are cancer cells acidic[J]．Br J Cancer,1991,64(4): 425-427．

[8]Gatenby R A,Gawlinski E T,Gmitro A F,et al．Acid-mediated tumor invasion:a multidisciplinary study[J]．Cancer Res,2006,66 (10):5216-5223．

[9]Spugnini E P,Citro G,Fais S．Proton pump inhibitors as anti vacuolar-ATPases drugs:a novel anticancer strategy[J]．J Exp Clin Cancer Res,2010,29(1):44．

[10]Voilley N,De Weille J,Mamet J,et al．Nonsteroid anti-inflammatory drugs inhibit both the activity and the inflammation-induced expression of acid-sensing ion channels in nociceptors [J]．J Neuroscience,2001,21(20):8026-8033．

[11]Julius D,Basbaum A I．Molecular mechanism of nociception[J]．Nature,2001,413(6852):203-210．

[12]岳冬梅,申文,陈立平,等．蛛网膜下腔注射甲氨蝶呤对大鼠胫骨癌痛的影响[J]．中华麻醉学杂志,2011,31(9):1065-1067．

Pain relief effect of amiloride regional injection in rat model of tibial bone cancer

Bone neoplasms Pain Amiloride

2012-12-13）

（本文编辑：严玮雯）

313000 湖州市中心医院麻醉科（胡四平、汪卫星、刘洋、吴鹤芬、余亮），中心实验室（王翔）；徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室（刘鹤）

胡四平，E-mail：hsp0526@163.com

【 Abstract】Objective To assess the pain relief effect of amiloride regional injection in a rat model of tibial bone cancer pain．Methods Thirty-two female SD rats were randomly divided into 4 groups(n=8 in each group):Cont group,Sham group, bone cancer pain group(BCP group),bone cancer pain and amiloride group(A group)．Fibial bone cancer pain was induced by injection of breast cancer Walker-256 cells into marrow cavity of upper tibia bone in BCP and A groups,amiloride(A group)or normal saline(BCP group)were injected around upper tibia bone at d7 after the model induced．Rats in Sham group were injected with Hank solution into marrow cavity of upper tibia bone,and normal saline around upper tibia bone at the same time points．The mechanical withdrawal threshold(MWT)was measured at d1 before(T0)and d7 after injection(T1)of Walker-256 cells or Hank's solution;30 min(T2)and 1(T3),2(T4),4(T5)and 8h(T6)after injection of amiloride or normal saline．Results Compared to the baseline,MWT was significantly decreased and the score of walk-associated ambulatory pain was increased in BCP and A group at all time points;compared to control group,MWT was significantly decreased and the score of walk-associated ambulatory pain was increased in BCP and A group at all time points;compared to BCP group,MWT was significantly increased and the score of walk-associated ambulatory pain was decreased at time points T2～T5in A group;compared with T1,MWT was increased and the score of walk-associated ambulatory pain was decreased in A group at time points T2～T5． Conclusion Regional injection of amiloride can reduce mechanical allodynia in a rat model of tibial bone cancer pain．