清热安宫丸等中成药微生物限度检查方法验证

黄 英

(云南省丽江市食品药品检验所，云南 丽江 674100)

根据2010年版《中国药典(一部)》规定，在进行药品微生物限度检查时，应对所用方法进行验证，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查[1]。有些中成药含有较强的抑菌成分，由于抑菌成分的干扰，采用常规法进行微生物限度检查，其结果不能真实反映其污染的微生物状况。为使检测结果科学、准确，检测前应进行方法学验证。笔者对清热安宫丸等中成药进行了方法学验证试验，现报道如下。

1 试验材料

1．1 菌种

枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均由云南省食品药品检验所提供。

1．2 培养基

营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉汤、改良马丁、改良马丁琼脂，MUG、麦康凯琼脂、胆盐乳糖、乳糖胆盐发酵培养基为北京三药科技开发公司和北京牛牛基因技术有限公司产品，按规定进行培养基的适用性检查均为合格。稀释剂为pH=7．0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1．3 样品

妇康宁片(江西华太药业有限公司，0．25 g/片)，复方川贝精片(广东一力集团制药有限公司，100片/瓶)，归脾丸(云南省腾冲制药厂，9 g/丸)，舒肝益脾颗粒(重庆陪都药业股份有限公司，10 g/袋)，补肾宁片(山东希力药业有限公司，0．2 g/片)，荆防颗粒(昆明中药厂有限公司，15 g/袋)，抗宫炎胶囊(江西心正药业有限责任公司，0．5 g/粒)，宁心安神胶囊(西安方兴制药有限公司，0．5 g/粒)，抗病毒片(天津金世制药有限公司，0．32 g/片)，消咳喘片(哈药集团三精黑河药业有限公司，0．3 g/片)，藿香正气滴丸(天津天士力制药股份有限公司，2．6 g/袋)，消栓颗粒(黑龙江省济仁药业有限公司，4 g/袋)，清热安宫丸(江西国药有限责任公司，3．5 g/丸)。

2 方法与结果[1]

2．1 菌液制备

取经30～35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物1 mL，用0．9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10-7～10-5，使成50～100 cfu/mL，经活菌计数后备用。

取经23～28℃ 培养24～48 h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1 mL，用0．9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10-6～10-5，使成50～100 cfu/mL，经活菌计数后备用。

取经23～28℃培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，用5 mL含0．05%聚山梨酯80的0．9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸出孢子悬液1 mL至无菌试管内，用含0．05%聚山梨酯80的0．9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。

2．2 供试液制备

称取样品10 g，加pH=7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，制成1∶10均匀的供试液。

2．3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证试验

2．3．1 平皿菌落计数法(常规法)

取1∶10供试液1 mL入皿，然后每皿加营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基15～20 mL，摇匀，按2010年版《中国药典(一部)》附录微生物限度检验方法进行，计算3次试验的平均回收率。结果见表1。结果表明，妇康宁片、复方川贝精片、归脾丸、舒肝益脾颗粒、补肾宁片、荆防颗粒6个品种对5株试验菌无抑菌作用，回收率均高于70%，可用常规法检查。其他品种对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有不同程度的抑菌作用，需改用培养基稀释法或离心薄膜过滤法重新验证。另外，各品种对大肠埃希菌、白色念珠菌及黑曲霉无抑菌作用，回收率均高于70%，因此霉菌和酵母菌数计数，均可用常规法检查。

2．3．2 培养基稀释法

取1∶10供试液1 mL，注入5个平皿中(每平皿0．2 mL)，然后每皿加营养琼脂培养基15～20 mL，摇匀，按2010年版《中国药典(一部)》附录微生物限度检验方法进行，计算3次试验的平均回收率。结果见表2。可见，抗宫炎胶囊、宁心安神胶囊、抗病毒片、消咳喘片4个品种采用培养基稀释法(0．2 mL/皿)法，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌回收率均大于70%。

表1 清热安宫丸等中成药常规法(1 mL/皿)各试验菌回收率(%)

表2 培养基稀释法(0．2mL/皿)和离心沉淀法＋薄膜过滤法回收率(%)

2．3．3 离心沉淀法＋薄膜过滤法

取1∶10供试液10 mL，移至灭菌离心管中，用500 r/min离心3 min，取上层液1 mL加入100 mL稀释液(pH=7．0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液)中，经减压抽滤干净后，用pH=7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次约100 mL，共冲洗400 mL/膜，在最后一次冲洗液中加入菌悬液1 mL(50～100 cfu/mL)。滤干后取膜，菌面向上贴于营养琼脂平板，经35℃培养3 d后，点计菌落数。计算3次试验的平均回收率，结果见表2。可见，藿香正气滴丸、消栓颗粒、清热安宫丸3个品种采用离心薄膜过滤法，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌回收率均大于70%。

2．4 控制菌检查验证试验

试验组:取规定量供试液及10～100 cfu试验菌株，加入相应规定量的培养基中，按各控制菌检查法检查。

样品组:取规定量供试液，加入相应规定量的培养基中，按各控制菌检查法检查。

控制菌检查结果:试验组检出试验菌，样品组未检出控制菌。各必检控制菌均可用常规法检查。

3 讨论

中成药中往往含有多种具有抑菌活性的中药材，其抑菌作用是几种药材抑菌作用的共同体现。宁心安神胶囊处方中含有抑菌成分(丹参、黄连)、抗病毒片处方中含有抑菌成分(连翘、广藿香)、消栓颗粒处方中含有抑菌成分(黄芪)、清热安宫丸处方中含有多种抑菌成分(大黄、黄芩、黄柏、栀子、黄连、冰片)等。据文献报道[2-4]，上述处方中的黄芩、黄柏、黄连、栀子、连翘、冰片、黄芪、丹参、大黄等多味中药均对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等有抗菌作用，所以对5株代表菌中的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌较敏感，说明抑菌作用的强弱，与处方中所含的抑菌成分的种类、数量及处方中药物间的相互作用有关。由于抑菌成分的影响，可能阻止某些敏感细菌的生长繁殖，不能真实地反映药品污染菌的程度。因此需要针对每个品种进行方法验证以确定检验方法的可行性，根据药品抑菌作用的强弱，选择合适的方法进行微生物限度检查。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京:中国医药科技出版社，2010:附录79-附录88．

[2]特玉香，刘 鹏，戴 翠，等．黄连上清丸微生物限度检查方法验证浅析[J]．药物分析杂志，2006，26(11):1 674-1 677．

[3]宋 勤，杜平华．中成药微生物限度检查方法的探讨[J]．中国药事，2006，20(1):46-47．

[4]于风平，杨美琴，特玉香，等．含大黄、黄芩、黄连和黄柏药材的中成药微生物限度检查法的建立[J]．药物分析杂志，2010，30(3):558-562．