石荠 提取物对流感病毒感染小鼠氧自由基损伤的保护作用＊

臧家娜，邓丽丽，余陈欢，方 杰，应华忠，吴晓宁

(1．浙江中医药大学，浙江 杭州 310053;2．浙江省医学科学院，浙江 杭州 310000;3．浙江医学高等专科学校，浙江 杭州 310053)

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒感染引起的常见的呼吸道急性传染病。临床常用的西药仅通过抑制病毒表面受体而发挥疗效，极易产生耐药性和不良反应[1]。中药为中华民族瑰宝，在防治流感病毒方面具有独特的优势。石荠 (M．scabra)为江浙地区常用中草药，省地方标准收录药材，在我国分布广阔，具有清热解毒、理气化痰的功效，主治流行时疫、痰湿内蕴、疮毒和慢性支气管炎等症。项目组前期研究表明，石荠 提取物(MSE)可显著改善流感病毒小鼠病理状态，延长其存活时间，提高机体免疫水平[1-2]。此外其还具有抗炎[3]、抗氧化[4]等多种药理作用，但其抗流感病毒的具体机制尚不清楚。因此，本试验以氧自由基损伤为切入点，探讨MSE改善流感病毒性肺炎的机制。

1 材料与方法

1．1 仪器、试药与动物

DYQ-838型高速微型粉碎机(浙江瑞安永历制药机械有限公司);TU-1900型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);DC300型莱卡图像处理显微镜(德国莱卡公司)。石荠 药材采于2009年8月浙江浦江，经本校俞冰副教授鉴定为石荠 (Mosla scabra Thunb．)的干燥全草，阴干、粉碎、过40目筛，备用;利巴韦林泡腾片(浙江艾康礼德制药有限公司，批号为091210)。甲型流感病毒小鼠肺适应株A/PR/8/34，由浙江省疾病预防控制中心病毒所提供。病毒效价为1∶512。清洁级ICR小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，由中国科学院上海实验动物中心提供，实验动物许可证号:SCXK(沪)2010-0014;10日龄SPF鸡胚，由浙江省农业科学院提供。本试验在浙江省医学科学院ABSL2生物安全实验室进行。

1．2 方法

石荠 提取物的制备:称取石荠 干燥粗粉500 g，加药材20倍量的70%乙醇，于90℃水浴回流提取3次，每次1．9 h，提取液减压浓缩至含醇量10%左右抽滤，以除去树脂、叶绿素等杂质[5]，继续回收溶剂至无乙醇味，乙酸乙酯萃取，减压干燥、粉碎，得棕黄色浸膏粉末，作为供试样品(MSE)。临用前以无菌生理盐水溶解干浸膏粉末，配制成所需试验药物浓度。

分组及给药:取清洁级ICR小鼠，雌雄各半，按体重随机分为6组:正常对照组、病毒模型组、利巴韦林给药组(75 mg/kg)和MSE高剂量给药组(752 mg/kg)、中剂量给药组(376 mg/kg)，低剂量给药组(188 mg/kg)，每组10只。各组于攻毒前预先灌胃给药3 d，每次给予0．2 mL/10 g，于第3天给药2 h后在乙醚轻度麻醉下以10倍半数致死是(LD50)病毒量滴鼻感染小鼠，每只25 μL。连续给药至第8天试验结束。称重，处死，迅速取肺组织称重，计算肺指数及肺指数抑制率，观察肺脏形态，测定肺组织病毒载量[6-7]，并检测肺组织匀浆液中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性。

1．3 统计学处理

采用SPSS 17．0统计软件，数据以均数±标准差(X ±s)表示，以 P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 化学成分定性检查结果

通过碱性铝盐比色法测定了MSE中总黄酮的含量[1]，结果MSE中总黄酮以芦丁计，其平均含量为83．3%。

2．2 MSE对流感感染小鼠肺指数及病毒载量的影响

结果见表1。可见，病毒模型组肺指数最大，与正常对照组比较，具有显著性差异(P＜0．01)，MSE高、中、低各剂量给药组均可明显降低感染小鼠的肺指数，提高肺指数抑制率，减轻小鼠流感病毒所致肺炎的病变程度，并呈剂量依赖性;同时，MSE高、中、低各剂量给药组肺组织中流感病毒载量明显降低，其中MSE高剂量给药组肺组织中流感病毒载量降低最显著，与病毒模型组比较，具有显著性差异(P ＜0．01)。

表1 MSE对流感感染小鼠肺指数及病毒载量的影响(n=10，X±s)

2．3 MSE 对感染小鼠肺组织 MDA，SOD，GSH-Px，NOS 和iNOS含量或活性的影响

结果见表2。可见，病毒模型组感染小鼠肺组织中MDA含量、NOS及iNOS活性明显升高，SOD和GSH-Px活性明显降低，与正常对照组比较，具有显著性差异(P＜0．01);MSE各剂量给药组肺组织中各指标含量及活性均有不同程度的改善，且呈剂量依赖性。

表2 MSE对感染小鼠肺组织MDA，NOS，INOS，SOD，GSH-PX含量或活性的影响(X ± s，n=10)

3 讨论

现代医学研究表明，病毒在肺组织内复制的过程中，炎症细胞大量趋化、聚集和激活，并释放过量的炎症介质及氧自由基等，导致组织损伤。研究发现，通过抗氧化剂治疗，可减少流感病毒感染小鼠的肺损伤和死亡[8-9]。因此，本试验以氧自由基损伤为切入点，通过建立急性感染小鼠模型，探讨MSE改善流感病毒性肺炎的机制。

正常情况下，机体内有一套清除自由基的酶系(超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px)，机体的氧化和抗氧化系统存在动态平衡，生理条件下体内自由基处于低浓度动态平衡。当机体受到损伤，或因某种因素体内自由基产生过多或清除能力降低时，体内活性氧自由基增多，体内脂质过氧化反应加剧。另外，MDA作为脂质过氧化的重要降解产物，可用于评价机体脂质过氧化损伤的程度[10]。NOS主要有结构型一氧化氮合酶(cNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)2种亚型，iNOS主要由被激活的胶质细胞、中性粒细胞和巨噬细胞释放产生，一般在炎症中后期大量生成且持续较长时间，是炎症中后期脑损伤加重的重要因素[11]。

黄酮类化合物具有多酚结构，通过夺氢反应生成自由基中间体而阻断或终止自由基连锁反应链，从而阻止或抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应，抑制脂质过氧化物及其代谢产物丙二醛MDA和共轭二烯等毒性物质的生成。同时，黄酮类化合物还可调节和提高体内抗氧化酶活性[2]。

本试验结果表明，流感病毒感染后，病毒模型组小鼠肺组织中MDA含量、NOS活性及iNOS活性明显增加，SOD，GSH-Px和T-AOC活性明显下降，提示病毒感染肺组织存在明显的脂质过氧化损伤及抗氧自由基损伤的能力下降。经MSE给药干预后，小鼠肺组织中 SOD，GSH-Px和 T-AOC等活力增加，MDA含量明显减少，NOS及iNOS活性明显降低，提示流感感染小鼠肺组织脂质过氧化损伤明显减轻，抗氧自由基损伤能力明显增强。

综上所述，MSE能够有效减轻流感病毒引发的肺组织脂质过氧化损伤，提高机体的总抗氧化能力和抑制炎症反应，这可能是其减轻流感病毒性肺炎病理损伤的作用机制之一。

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