田力,田晓晔,于鑫琛,于洋,王瑞新,巴林
(沈阳医学院临床教研室,辽宁 沈阳 110034)
中药的临床运用多以复方的形式出现,遵循君臣佐使的配伍规律,以中医辨证论治为指导原则,具备功效的多向性和适应证的广泛性,能够起到调理、调节、调摄等综合作用,符合现代药物学对多成分药物的认识,复方是中药新药开发的主要对象,其质量标准的研究是中药研究的重要组成部分[1,2]。
抗粘灵气雾剂由白芨、黄芪、赤芍、当归等8味中药材组成,用于预防腹腔术后粘连,效果确切、方法简便易行,为临床外科领域术中抗粘连有效药物。为了保障临床用药安全有效,抗粘灵气雾剂的质量控制显得尤为重要[3-8]。本文首次对抗粘灵气雾剂处方中当归、赤芍等主要药材进行了TLC法鉴别,选择阿魏酸、芍药苷为评价指标,采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)法进行定量测定,比较全面地对抗粘灵气雾剂的质量控制方法进行了研究[9,10]。
Agilent 1100高效液相色谱仪、Agilent1100紫外检测器(美国Agilent公司);BS110 型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);TG332A型微量分析天平(上海仪器有限公司);HH-2数显恒温水浴锅(金坛市新航仪器厂);ZF-1三用紫外线分析仪(上海精科实业有限公司)。
阿魏酸、黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所);白芨、黄芪、赤芍、当归、灯盏花、大黄(沈阳天益堂大药房)。
甲醇、石油醚、乙醇、环己烷、正丁醇、氯仿(分析纯,天津康科德科技有限公司);乙酸乙酯、浓硫酸、盐酸、甲酸(分析纯,沈阳化学试剂厂);冰醋酸(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);香草醛(分析纯,沈阳试剂三厂);二硝基苯肼(分析纯,上海化学试剂总厂所属试剂三厂);硅胶G(化学纯,青岛海洋化工有限公司);羧甲基纤维素钠(沈阳化学试剂厂)。
2.1 当归的薄层鉴别
2.1.1 阿魏酸对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量,加甲醇制成1.0 mg/ml的溶液,备用。
2.1.2 样品液的制备 按处方比例取当归药材及全方,精密称定,加8倍量85%乙醇,水浴回流2次,每次1.5 h,提取液置蒸发皿中,浓缩至干,取干膏粉末适量,加水1.0 ml,超声振荡使其溶解,制成相当于每1 ml中含1.0 g药材的溶液,离心(10 000 r/min)3 min,取上清液,即得。
2.1.3 阴性液的制备 精密称取除当归外的其他七味药材,按照“2.1.2”项下制备。
2.1.4 薄层色谱条件 薄层板:硅胶G自制板(按《中国药典》2010年版一部附录VIB项下方法制备);点样:对照品溶液点样2 μl,样品液点样2 μl;展开剂系统:环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.1);展开方式:在展开槽中加入展开剂,预平衡15 min后,上行展开;显色:365 nm紫外灯下观察;斑点检视:当归药材,样品液在与阿魏酸相应的位置上出现相同的荧光斑点,而阴性对照液中无相应斑点。
2.2 赤芍的薄层鉴别
2.2.1 芍药苷对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量,加乙醇制成1.0 mg/ml的溶液,备用。
2.2.2 样品液的制备 按处方比例取赤芍药材及全方,精密称定,加8倍量85%乙醇,水浴回流2次,每次1.5 h,提取液置蒸发皿中,浓缩至干,取干膏粉末适量,加水1.0 ml,超声振荡使其溶解,制成相当于每1 ml中含1.0 g药材的溶液,离心(10 000 r/min)3 min,取上清液,即得。
2.2.3 阴性液的制备 精密称取除赤芍外的其他七味药材,按照“2.2.2”项下制备。
2.2.4 薄层色谱条件 薄层板:硅胶G自制板(同“2.1.4”项下);点样:对照品溶液点样2 μl,样品液点样2 μl;展开剂系统:三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(35∶15∶5∶0.5);展开方式:在展开槽中加入展开剂,预平衡15 min后,上行展开;显色:5%香草醛硫酸溶液;斑点检视:赤芍药材,样品液在与芍药苷相应的位置上出现相同的蓝紫色斑点,而阴性对照液中无相应斑点。
2.3 黄芪的薄层鉴别
2.3.1 黄芪甲苷对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量,加乙醇制成1.0 μl/ml的溶液,备用。
2.3.2 样品液的制备 按处方比例取黄芪药材及全方,精密称定,加8倍量85%乙醇,水浴回流2次,每次1.5 h,提取液置蒸发皿中,浓缩至干,取干膏粉末适量,加水1.0 ml,超声振荡使其溶解,制成相当于每1 ml中含1.0 g药材的溶液,离心(10 000 r/min)3 min,取上清液,即得。
2.3.3 阴性液的制备 精密称取除黄芪外的其他七味药材,按照“2.3.2”项下制备。
2.3.4 薄层色谱条件 薄层板:硅胶G自制板(同“2.1.4”项下);点样:对照品溶液点样2 μl,样品液点样2 μl;展开剂系统:石油醚(60~90 ℃)-乙酸乙酯(17∶3);展开方式:在展开槽中加入展开剂,预平衡15 min后,上行展开;显色:2,4-二硝基苯肼乙醇溶液;斑点检视:黄芪药材,样品液在与黄芪甲苷相应的位置上出现相同的橙红色斑点,而阴性对照液中无相应斑点。
2.4 阿魏酸、芍药苷的同时含量测定
2.4.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流动相:乙腈-1.4%冰醋酸水溶液线性梯度洗脱,洗脱程序见表1;流速:1.0 ml/min;检测波长:275 nm;进样量:10 μl。
表1 冰醋酸水溶液线性梯度洗脱程序
2.4.2 供试品溶液的制备 按处方比例取白芨、黄芪、赤芍、当归、灯盏花、大黄药材粉末适量,精密称定,加8倍量85%乙醇,水浴回流2次,每次1.5 h,过滤,合并滤液,置于蒸发皿中,低温水浴浓缩至稠膏状,烘箱烘干。干膏用甲醇定容至10 ml,精密量取2 ml样品液于10 ml量瓶中,用甲醇定容至刻度。微孔滤膜过滤,取续滤液在上述色谱条件下进样分析。
2.4.3 色谱系统适用性试验 取供试品溶液,在“2.4.1”色谱条件下进样分析,理论塔板数按阿魏酸峰计算不低于3 000,按芍药苷计算不低于2 000,各色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5。拖尾因子均在0.95~1.05之间。
2.4.4 标准曲线的绘制 分别称取阿魏酸、芍药苷对照品适量,精密称定,分别置于10 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,配制成单组分对照品溶液,其中含阿魏酸0.051 mg/ml、芍药苷0.500 mg/ml。分别精密量取各单组分对照品溶液适量置10 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成混合对照品溶液,分别进样10 μl,记录色谱图。以对照品峰面积为纵坐标,对照品浓度为横坐标,绘制标准工作曲线。阿魏酸、芍药苷分别在2.04~20.4 μg/ml、32~400 μg/ml范围内,峰面积与浓度呈良好的线性关系。所得回归曲线方程阿魏酸y=36.521x-0.0485,r=0.9992;芍药苷y=0.5861x-3.2088,r=0.9993。
2.4.5 重复性 按处方比例精密称取各药材进行提取,共5份,按“2.4.2”项下方法操作,在“2.4.1”色谱条件下测定,阿魏酸、芍药苷含量的相对标准偏差分别为1.5%、1.3%。
2.4.6 仪器精密度 精密吸取混合对照品溶液,按照“2.4.1”项下色谱条件连续进样5次,阿魏酸、芍药苷的RSD分别为0.9%、1.2%。
2.4.7 回收率试验 按处方比例精密称取各药材,共9份,精密加入一定量对照品溶液,按“2.4.2”项下方法操作,在“2.4.1”色谱条件下测定,计算平均回收率。阿魏酸平均回收率为96.2%,RSD为1.5%;芍药苷平均回收率为97.3%,RSD为1.0%。
2.4.8 稳定性试验 取供试品溶液室温下放置,分别于0、2、4、8、12和24 h在“2.4.1”色谱条件下测定。结果表明,阿魏酸、芍药苷均在24 h内稳定,其RSD分别为0.7%、1.9%。
2.4.9 样品测定 按处方比例取各药材粉末共5份,精密称定,同“2.4.2”项下方法操作,在“2.4.1”色谱条件下进样,阿魏酸的平均含量为0.374 mg/g,芍药苷的平均含量为3.752 mg/g。
3.1 TLC的选择 参照《中国药典》2010年版中相关药材的薄层鉴别方法,本研究建立了抗粘灵气雾剂中当归、赤芍、黄芪的薄层鉴别方法。当归的鉴别采用环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶ 0.1)为展开剂,在硅胶G板上展开;赤芍的鉴别采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(35∶15∶5∶0.5)为展开剂,显色剂5%香草醛硫酸溶液,在硅胶G板上展开;黄芪的鉴别采用石油醚(60~90 ℃)-乙酸乙酯(17∶3)为展开剂,显色剂为2,4-二硝基苯肼乙醇溶液,在硅胶G板上展开。斑点分离较好,结果较为理想。
3.2 HPLC 本研究采用反相HPLC,同时测定了抗粘灵气雾剂中阿魏酸、芍药苷的含量,以乙腈-1.4%冰醋酸水溶液进行线性梯度洗脱,在275 nm波长处进行检测。实验结果表明:阿魏酸在2.04~20.4 μg/ml范围内线性关系良好,相关系数为0.9992,平均回收率为96.2%,RSD为1.5%;芍药苷在32~400 μg/ml范围内线性关系良好,相关系数为0.9993,平均回收率为97.3%,RSD为1.0%。该方法简便、准确、重复性好,为评价抗粘灵气雾剂质量提供了一个定量依据。
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