非热加工对食物过敏原影响的研究进展

谢秀玲，李 欣，高金燕，陈红兵*

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大学生命科学与食品工程学院食品系，江西 南昌 330047)

食物过敏是人们对食物的一种不良反应，也属医学领域的变态反应。它的临床症状表现主要有荨麻疹、疱疹样皮炎、口腔过敏综合症、结肠综合症、哮喘等，严重时可导致过敏性休克，危及生命[1]。在欧美等发达国家，食物过敏反应危害着约3%～4%的成年人和6%的儿童，而且发病率还在逐年增加[2]。我国尚缺乏大规模的流行病学调查数据，但小范围的调查以及大量的病例报道预示我国也处在一个增长的阶段。毋庸置疑，食物过敏严重影响了部分人群的生活质量，是一个值得高度关注的食品营养卫生与食品安全问题，通过食品加工控制食物过敏原并为食物过敏患者提供安全的食品是食品工业的重要任务之一。因此，本文主要介绍各种非热加工对食物过敏原的控制研究，通过各种非热加工的处理，探究食物过敏原的致敏性的变化，期望在不改变食物营养价值的条件下，获得脱敏性食物，满足食物易敏人群的正常饮食需求。

1 食物过敏的致敏成分

食物中多种成分都有可能导致食物过敏，但目前一致认为食物中的蛋白质是最主要的致敏成分，因此也备受关注，人们常称之为食物过敏原。过敏原蛋白是食物过敏反应的主要诱因，而过敏原表位是过敏反应的物质基础。过敏原表位包括线性表位和构象性表位，线性表位一般由5～7个氨基酸组成，是与抗体结合的连续氨基酸序列，而构象性表位则是由15～22个氨基酸构成，这些氨基酸分布于同一条肽链的不同部位或不同肽链上[3]。有研究[4]报道表明，在天然状态下，过敏原蛋白有90%以上的表位是构象性表位。过敏原蛋白空间结构不稳定，易随外界环境的变化而发生空间分布的改变。由于食品加工可以影响食物过敏原结构及其致敏性表位，尤其构象性表位易受影响。因此，通过各种加工技术可能控制食物过敏原的致敏性，从而为构建食物过敏原脱敏制备技术提供理论可行性。

2 非热加工控制食物过敏原

食物的加工技术主要包括热加工和非热加工，采用传统的热加工手段，过敏原蛋白质易变性而改变过敏原结构，影响其致敏性，但却会导致产品的深加工受到限制，而且热加工参数的范围也有限，从而无法在有限的加工条件下，针对不同过敏食物，寻求到更多的既降低致敏性又保留其再加工性能的方法。而非热加工技术手段实现了在低温条件下处理食物过敏原，既能保存食物的营养物质、新鲜感和风味，又能更大范围地改变过敏原的结构，从而影响其致敏性。非热加工控制食物过敏原的方法包括物理、化学、酶法以及生物学方法。

2.1 物理方法

2.1.1 超高压

过敏原蛋白质的空间三维结构是由多肽链相互折叠而成，超高压会影响氢键、离子键、疏水键等非共价键[5]，破坏蛋白质三级、四级结构，但对共价键没有影响[6]。有研究[7]报道，小于150MPa的压力能促进蛋白质低聚体的结构解离；大于150MPa的压力会使蛋白质解链和解离后的低聚体亚单位重新聚合；尤其在200MPa以上的压力条件下蛋白质的三级结构会发生剧烈变化。

食物过敏原经超高压处理后，过敏原蛋白的致敏性、水解能力、疏水性等各种功能结构特性改变。Chicón等[8]在pH6.8条件下分别采用200MPa和400MPa压力处理牛乳中过敏原β-乳球蛋白，β-乳球蛋白与兔抗IgG的结合能力增加，推测可能由于高压导致蛋白空间结构发生变化，影响其致敏性。而Kleber等[9]则采用不同的压力(200、400、600MPa)对β-乳球蛋白分别处理10、30min后，发现分子内弱的非共价键发生断裂并重新聚合，致敏性随着压力和时间的增加而增加。Pe as等[10]研究发现，经100MPa压力处理后，大豆乳清蛋白水解能力没有变化，而用200MPa和300MPa的压力处理后，水解能力明显增加，且经300MPa压力处理后，水解产物几乎没有致敏性。Zeece等[11]用800MPa的压力对β-乳球蛋白处理后，得出β-乳球蛋白在不到1min的时间内几乎全部被消化完全，并降解成小于1500D的小分子物质，高级结构基本破坏。董晓颖等[12]在对虾过敏原致敏性的研究中发现，经100～500MPa的压力处理后其致敏性呈现先降低后增加的趋势，在压力为400MPa时处于最低点。他们分析这可能是由于在压力变化过程中蛋白质结构发生可逆变化，过敏原表位开始时被掩盖，后来随压力的增加过敏原表位逐渐暴露。谢丹丹等[13]则用150MPa压力处理南美白对虾35min后，其水溶性蛋白的致敏性降低。此外，作者所在课题组在前期研究中发现，鸡蛋过敏原卵白蛋白经高压处理后，其致敏性先降低后升高，推测当压力在40～90MPa时，卵白蛋白分子结构展开，疏水性基团暴露，其致敏性随压力的升高而降低；在120～180MPa时，卵白蛋白分子一方面在β-折叠结构交联的作用下形成聚合体，另一方面由于压力过大，已形成的一些凝聚体又被打破形成可溶性聚合体，导致卵白蛋白的致敏性升高[14]。另外，还得出经超高压处理后花生过敏原蛋白Ara h 2、Ara h 6与抗体的结合能力随着压力的升高而降低，抗原性明显降低，而且粗蛋白溶液中的其他成分不影响Ara h 6蛋白在超高压处理过程中的抗原性变化，也显示了超高压处理控制食物过敏原致敏性的功能[15-16]。

2.1.2 辐照

辐照能够使部分蛋白质分子发生解聚、交联、裂解，致使蛋白分子的空间结构、构象改变，从而改变食物致敏性[17]。比如，Kume等[18]用0～7kGy的辐照剂量处理鸡蛋过敏原卵白蛋白，蛋白质三级结构受到影响，其表面疏水性随着辐照剂量的增加逐渐增加；且经4kGy剂量处理后有明显的聚合现象，聚合后其致敏性进一步降低。Byun等[19]则研究发现辐射处理后，对虾的热稳定蛋白与IgE的结合能力降低。在2002年，Byun等[20]分别又用0～10kGy的辐照剂量处理牛乳过敏原β-乳球蛋白，结果表明高剂量的辐照破坏了β-乳球蛋白的表位结构，使其不能准确地识别IgE的结合位点，当辐照剂量大于7kGy，与IgE的结合能力小于50%。顾可飞等[21]对虾过敏原Pen a 1进行辐照处理后，其结构出现可逆变化，0～7kGy剂量辐照处理时，该蛋白发生空间结构改变，双螺旋解聚，双链打开，疏水性基团外露，而当辐照剂量在7kGy和10kGy时，疏水性有所减弱，他们认为蛋白质肽链发生聚合、交联、解聚、断裂等一系列变化，出现一些聚合物和降解肽段，这些产物的致敏性明显降低。这一发现也证实并解释了Byun等[19]之前的研究结果。而刘光明等[22]发现粗提取的蟹类过敏原原肌球蛋白经3～7kGy的辐照处理后过敏原性无明显变化，10kGy辐照处理后其过敏原性降低。另外，本课题组的研究表明，辐照处理对花生过敏蛋白Ara h 2和Ara h 6的二级结构影响很大，且当处理剂量为5kGy时，其二级结构即有明显变化。Ara h 2经辐照处理后，抗原性明显降低，且随着辐照剂量增加，抗原性逐渐降低，10kGy处理可使Ara h 6的抗原性降低95%，即10kGy辐射处理可基本消除Ara h 6的抗原性[15-16]。该研究结果再次显示了辐照处理在制备脱敏蛋白中的强大功能，但是，由于强辐照会产生剂量残留，因此，辐照对过敏原蛋白结构的影响仍有许多未解决的问题。

2.1.3 超声波

超声波为频率高于20kHz以上的有弹性的机械振荡，能使食品中的大分子物质发生机械性断键作用和自由基的氧化还原反应，导致其共价键断裂，分子降解，结构改变[23]。比如唐传核等[24]用15kW超声波处理大豆分离蛋白，结果显示其出现了部分二硫键缔合及分子重排现象，三级结构改变。李振兴[25]利用30kHz、800W、50℃的超声波处理南美白对虾4min，发现虾提取物的免疫活性有明显降低，经免疫印迹实验得出虾主要过敏原Pen a 1的IgE识别的蛋白质条带减弱，这可能由于Pen a 1被降解为分子质量较小的多肽，破坏了过敏原Pen a 1的IgE的识别位点。本课题组开展的超声波对牛乳过敏原β-乳球蛋白影响的研究，发现β-乳球蛋白的一级结构表现较强的稳定性，二级和三级结构仅发生微弱变化，具有降低该β-乳球蛋白致敏性的作用[26]。目前超声加工控制食物过敏原的工作刚起步，该技术对过敏原蛋白结构的影响值得深入探讨。

2.1.4 高压脉冲电场

高压脉冲电场处理食物采用高电压(0～50kV)、短脉冲及温和温度，具有传递均匀、作用时间短、产热少、能耗低、对食物的营养成分和感官特性影响小等优点。目前利用高压脉冲电场对食物过敏原进行处理，结果显示过敏原蛋白的疏水性变化最为明显。比如Li等[27]研究发现随着脉冲强度、脉冲宽度增大及脉冲时间延长，大豆分离蛋白的疏水性和巯基含量都增加。但当脉冲强度为40kV/cm、样品流速为40mL/min，疏水性和巯基含量略有降低。张铁华等[28]用高压脉冲电场的方法处理蛋清蛋白后，发现蛋清蛋白的疏水性先随脉冲电场强度的增加而增大，但当脉冲电场强度大于30kV/cm后，其疏水性下降。在2011年，赵伟等[29]利用高压脉冲电场处理蛋清蛋白得到相同的结果，其原因是随着高压脉冲电场处理强度(电场强度和处理时间)增加，蛋白质表面疏水基团和巯基增多，当外露的疏水基团增加到一定程度时，蛋白质分子间发生疏水相互作用，发生“疏水塌陷”，蛋白质表面疏水性下降，蛋白质聚集。此外，Chung[30]、Yang[31]等对脉冲紫外线方面的研究比较深入，他们分别对不同的食物过敏原进行脉冲紫外线处理，获得非常理想的成果，研究发现当花生过敏原蛋白经脉冲紫外线处理4min，Ara h 1和Ara h 3的IgE的结合能力降低了6～7倍，随着时间和光强度的增加，Ara h 2的致敏性也大大降低；大豆蛋白提取液经脉冲紫外线处理，小分子蛋白(14～50kD)含量降低，而大分子蛋白(150～250kD)含量增加，明显有聚合现象[32]；虾的过敏原原肌球蛋白的致敏性也明显受到脉冲紫外线处理的影响[33]。而脉冲紫外线对过敏原蛋白结构的影响尚未有相关报道，有待进一步研究。本课题组的研究表明，牛乳过敏原β-乳球蛋白受到脉冲电场作用后，一级和二级结构均受到不同程度的影响，蛋白部分降解且α-螺旋和不规则卷曲发生相互转化。变化最为明显的是三级结构，随着脉冲数的增大，疏水基团暴露程度增大，色氨酸荧光强度降低。但遗憾的是，β-乳球蛋白受到脉冲电场作用后，其致敏性变化并没有规律性[26]。近年来，高压脉冲电场的加工技术手段渐渐被研究人员采用，高压脉冲电场处理食物过敏原研究鲜见文献报道，但仍然是值得高度关注的新技术。

2.2 化学方法

2.2.1 糖基化

糖基化是通过美拉德反应对过敏原蛋白进行改性的一种方法，即碳水化合物与蛋白质分子的氨基或羧基以共价键相结合。碳水化合物能够掩饰或破坏过敏原蛋白分子上的致敏表位，从而改变其致敏性。

目前应用糖基化法改变过敏原致敏性已有很多报道。比如，Hattori等[34]研究褐藻酸低聚糖、磷酸基低聚糖对牛奶中主要过敏原β-乳球蛋白的影响，发现当β-乳球蛋白分别与褐藻酸低聚糖、磷酸基低聚糖的比例是1:6、1:8时，β-乳球蛋白的二级、三级结构虽没有发生很大变化，但糖基化产物使体内IgE[35]和T细胞[36]的水平得到降低，这说明加入的糖类掩饰了过敏原蛋白的致敏表位和抗体的识别位点，形成的糖基化产物明显降低β-乳球蛋白的致敏性。Bu等[37]运用响应面法对不同蛋白质/糖比例、温度及时间进行条件优化，确定对乳清致敏性影响的最佳条件，得出当乳清与葡萄糖的比例为1:5.96、温度52.8℃、作用时间78h时，α-乳白蛋白的致敏性下降95.22%，研究者推测由于美拉德反应，α-乳白蛋白的构象结构发生很大程度的改变，导致其致敏性降低。李庆丽等[38]选取麦芽糖、葡萄糖与虾过敏原发生美拉德反应后，虾过敏原分子质量增大，麦芽糖、葡萄糖使虾的过敏原免疫活性分别降低了约60%和10%。而Jiménez-Saiz等[39]研究发现，当葡萄糖与鸡蛋过敏原卵白蛋白的比例是1:0.05时，会产生高聚物，隐藏或改变了过敏原表位，使卵白蛋白与IgE的结合能力和消化能力降低。本课题组开展干法状态下卵白蛋白糖基化对其结构与致敏性影响的研究，结果表明，糖基化降低了卵白蛋白的IgE结合能力，IgE结合能力的变化主要是构象的变化而不是糖基引入导致的线性表位的破坏，糖基化后二级结构β-折叠和β-转角的变化是导致其致敏性改变的主要原因[40]。总之，糖基化是食品加工中常见的一种现象，探索其对过敏原的影响具有重要的现实意义。

2.2.2 甲基化修饰

蛋白质是由多种氨基酸组成，赖氨酸和精氨酸的残基上有甲基化位点。组蛋白合成后，以硫代腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在组蛋白甲基转移酶的催化下，将甲基转移到蛋白质的赖氨酸或精氨酸残基上，改变过敏原蛋白质的结构组成，影响其致敏性。如Mine等[41]发现经甲基化处理的卵转铁蛋白、卵类黏蛋白和溶菌酶的IgE的结合能力分别降低了22.6%、18.6%和23.8%。Fujita等[42]研究鱼类过敏原卵黄蛋白有很强的耐消化能力，经羧甲基化修饰后，鱼类过敏原肽键断裂和内部结构发生变化，其消化能力降低，与IgE的结合能力也降低。

有关甲基化修饰过敏原蛋白的研究并不多，从蛋白的生物合成过程而言，这是蛋白后修饰的一种方式，笔者认为将食物过敏原蛋白进行甲基化，其安全性值得进一步评估。

2.2.3 蛋白质磷酸化

蛋白质磷酸化被认为是提高蛋白功能特性的有效手段。大多数蛋白质在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，有的酪氨酸上也有磷酸化位点。磷酸根基团可以增加蛋白质的电负性，提高蛋白质分子之间的静电斥力，使其更易分散，因而提高其溶解度，改善其乳化性、起泡性。比如，熊柳等[43]用三聚磷酸钠对花生分离蛋白进行磷酸化改性，发现在44.85℃和pH8.24的条件下，加入7.77%的三聚磷酸钠，花生蛋白的吸水性、持水性、乳化性等特性都有不同程度提高。磷酸根基团对过敏原蛋白的修饰可以影响其各功能特性，也可能会引起其致敏性的改变。除此以外，目前也有用其他化学试剂对食物过敏原进行修饰的研究报道，如Marzban等[44]用二硫苏糖醇处理苹果中的主要过敏原Mal d 2，结果发现其α-螺旋结构展开，二硫键断裂，破坏了蛋白质的二级、三级结构，使IgE结合表位暴露，致敏性增加。

以上综述表明，化学方法对食物过敏原的影响主要通过修饰蛋白质的氨基酸残基来实现，这都可能会影响到过敏原的表位结构。因此，化学方法控制过敏原致敏性具有重要作用，值得进一步探索。

2.3 酶法改性

2.3.1 酶交联

目前普遍认为，蛋白质的致敏性与其空间结构有着密切的关系。而酶交联则是利用一种或多种酶催化蛋白质内部各多肽链之间，或催化蛋白质各分子之间形成共价键而发生交联反应，改变了原有蛋白质的空间结构，形成大的聚合物，从而使过敏原蛋白的致敏性有所变化。如Chung等[45]用过氧化物酶处理烘烤过的花生，发现与未用酶交联烘烤花生相比，花生过敏原与IgE的结合能力减弱。在此基础上，Chung等[46]又用多酚氧化酶交联花生中的Ara h 1、Ara h 2两种主要过敏原，交联后的蛋白单体含量均有所减少，高聚物含量增加，同时，交联物与IgE结合能力也有所降低。Leszcyńaka等[47]则发现，经转谷氨酰胺酶交联后，小麦麦谷蛋白的致敏性降低30%。这可能由于转谷氨酰胺酶改变了过敏原的内部结构，掩埋了过敏原表位，使其致敏性降低。本课题组的初步研究结果显示，多酚氧化酶交联后的乳清蛋白，其乳化性及其稳定性和起泡性及其稳定性均发生了较大变化，交联后的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白以及β-酪蛋白的抗原性明显降低，显示了多酚氧化酶交联过敏原蛋白并降低其致敏性的趋势[48]。总之，利用酶交联技术研究食物蛋白结构与其过敏原性关系，将为降低食物过敏原的致敏性提供全新的科学理念，值得深入研究。

2.3.2 酶降解

酶降解是通过断裂酰胺键破坏其一级结构而产生小分子肽段来降低其致敏性，也可通过改变过敏原的致敏性表位的三维结构来降低其致敏性[23]。如聂君等[49]用蛋白水解酶菠萝蛋白酶、非蛋白氧化酶葡萄糖氧化酶分别处理蛋清，得出用菠萝蛋白酶处理后的蛋清致敏性最低，致敏性降低约79.63%，其效果是非蛋白氧化酶葡萄糖氧化酶和高温加热处理(121℃、10min)的3倍。这是单一酶对鸡蛋过敏原的影响，多种酶的联合影响也有相关报道，Fritsche等[50]用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶共同作用于鸡蛋全液，结果得出其致敏性显著降低。Koppelman等[51]对花生过敏原的研究中发现，用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理时，花生的Ara h 1、Ara h 3能迅速被胃蛋白酶消化，而Ara h 2、Ara h 6则需要在较高的胃蛋白酶浓度条件下才能被消化。如，沈小琴等[52]用碱性蛋白酶水解乳清蛋白，发现α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性分别降低了50.02%和99.72%。在酶降解中，碱性蛋白酶的应用范围较广，主要由于碱性蛋白酶是内肽酶，水解蛋白质分子内部的肽健，生成分子质量较小的多肽，破坏分子内部的过敏原表位结构，影响食物致敏性高低。

目前，利用酶水解牛乳生产低致敏婴儿奶粉的技术已广泛应用于工业生产中，在一定程度上降低了牛乳对过敏体质儿童的危险性。然而牛乳在酶解过程中，不可避免地会产生苦味肽，这大大影响了牛乳原有的风味，制约着低致敏奶粉的发展。与此同时，利用酶改性技术研发其他种类低致敏食品尚处于起步阶段。总之，酶法改性食品蛋白技术可以降低甚至消除食品蛋白的过敏原性，为低致敏蛋白/蛋白食品的研发提供了一个很好的思路，具有广阔的应用前景。

2.4 生物方法

2.4.1 基因工程

利用基因工程的方法主要是对编码过敏原蛋白的基因序列进行突变，修饰相应的序列和结构，改变其线性表位和构象性表位组成，从而达到改变致敏性的目的。比如，Herman等[53]报道，采用基因抑制的方法处理大豆过敏原Gly m Bd 30K，结果成功表达出非致敏性的蛋白。Sathe等[54]采用基因沉默技术同样消除了苹果的过敏原Mal d 1的致敏性。当然也可以通过基因重组的方法改变过敏原的致敏性，比如，易海涛等[55]将花生的主要过敏原Ara h 2的3个最主要的IgE抗原表位断开，再进行重新组合使其次序颠倒，结果发现与未突变的Ara h 2相比，其免疫反应性有明显降低。此外，杨振煌[56]采用基因重组技术对苦荞过敏原Fag t 1的核苷酸序列进行重新构建，并将重组分子在原核载体中表达获得几种重组蛋白，这些重组蛋白由于失去天然蛋白结构而丧失了IgE结合能力，免疫活性降低了约90%。

基因工程能够高效地改变过敏原的致敏性，但由于转基因食品普遍受到公众的排斥，因此，对于基因工程能否实际应用于食物致敏性的消除，还需进一步讨论。

2.4.2 发酵

发酵可以改变食品中各组分含量，通过微生物及其分泌的酶系作用，可以把不溶性高分子物质分解成为可溶性低分子化合物。因此，对于导致机体产生过敏反应的大分子蛋白质必然会受到影响。在1999年，Lucjail等[57]就采用嗜热乳酸菌和嗜温乳酸菌发酵灭菌乳，结果发现牛乳中的β-乳球蛋白的致敏性降低。在2001年，Besler等[58]也用嗜热、嗜温的乳酸菌对牛奶进行发酵，同样发现牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的致敏性降低90%。近几年来，发酵方法不断改进，应用范围不断扩大。如Frias等[59]研究L.plantarum对大豆蛋白的致敏性影响，结果发现L.plantarum使其致敏性降低了4%。Leszczyńska等[60]将乳酸杆菌和酵母菌混合，分别通过同型和异型乳酸发酵研究对小麦粉的过敏蛋白的影响，结果发现小麦醇溶蛋白的致敏性显著降低，且小麦中总过敏原的IgE结合能力降低20%。Sen等[61]用德式乳杆菌发酵鸡蛋的卵白蛋白，发现其IgE的结合能力降低50%，他们认为可能由于过敏原蛋白分子内二硫键的变化，引起结构改变，蛋白分子发生降解。总之，发酵降低食物致敏性具有明确的效果，对于轻度过敏患者选择发酵食品是一个不错的解决方案，但完全消除还是有一定困难。针对发酵食品，开展食物过敏原致敏性控制研究具有明显的应用价值。

3 结 语

近10年来，非热加工技术已经成为国内外食物加工技术研究的热点，它具有操作简单、营养成分损失少、保持原有的感官特性、节能环保等优势。因此，非热加工方法越来越广泛应用于食物过敏原的研究中。随着研究的深入，发现有些非热加工仅仅停留在对过敏原结构的影响上，而没有对其致敏性作进一步研究。同时还发现每种方法都有其局限性，所以各加工方法之间的联用技术也成为今后一个新的研究发展方向。另外，对食物过敏原的研究大部分局限在实验阶段，仅有酶解技术应用到实际生产中，但无法满足实际需求。迄今为止，我国还没有自主知识产权的脱敏食品，过敏患者的安全饮食还有很多问题需要解决，而利用非热加工来降低食物过敏原的致敏性，为脱敏食品的生产提供了一条新的探索途径并显示了强大潜力。

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