植物内生菌促进宿主氮吸收与代谢研究进展

杨 波，陈 晏，李 霞，任承钢，戴传超，*

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏省微生物与功能基因组学重点实验室，江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心，南京 210023;2.江苏省农业科学院粮食作物研究所，南京 210014)

氮的有效供给是农业可持续发展的基本保证之一，为了满足人口增长对农产品的需求，提高单位土地面积的粮食产量，农田氮肥用量逐年增加。但是，大量偏施氮肥使土壤物理性状恶化、化肥利用率迅减;氮素的淋失直接污染水资源、造成水体环境的富营养化;偏施氮肥也不利于农作物产量进一步提高和优质农产品的生产［1］。因此，近年来关于如何促进植物氮吸收、提高氮肥利用率、减少氮肥施用的研究已成为全球农业与生物科学领域的一大热点问题。植物-内生菌的共生关系是近年来研究提高植物氮素利用的新领域。

植物与周围环境生物的互作是一种普遍现象，其中植物-微生物的相互作用是重要形式之一。在叶际和根际区域，植物体时刻与众多的有害、有益和中性微生物共同生存，并产生直接或间接的接触。在长期的协同进化过程中，植物对微生物的侵染已经形成一种适应性的机制，能识别来自微生物的信号分子并作出相应的生理反应。13C同位素标记技术显示根际组织中存在相当复杂的植物-真菌、植物-细菌共生体，对促进植物养分吸收和提高植物抗性起重要作用［2］。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物的方法来证明其内生［3］，而且内生菌能与植物形成互惠互利的共生关系［4］，如产生多种植物激素、促进植物生长、提高植物氮吸收与氮代谢水平［5-6］。本文综述了近年来有关植物内生菌促进宿主氮吸收、提高宿主氮代谢、减少氮肥施用的研究进展，以使读者全面、及时的了解这一领域的研究动态。

1 植物内生菌促进宿主氮吸收

1.1 植物内生菌促进宿主对无机氮素的吸收

1.1.1 植物内生菌通过促进宿主根部发育获得更多无机氮素

土壤中的氮素和施入土壤中的氮肥经根系才能进入植物体内，而植物吸收氮素能力的强弱很大程度上取决于根系形态特征、分布及其根系活力。如水稻根系在形态上表现为根系总长、根系半径、根体积和有效吸收面积等，水稻根系的纵向分布与其氮素吸收的关系也十分密切［7］，而内生菌能够促进根的生长和根系活力［8］。Dai等人［9］研究发现接种广谱植物内生真菌B3能促进水稻生根;袁志林等人［10］表明水稻接种内生真菌后能提高水稻的根系活力。Redman等人［11］研究表明，内生菌的定殖促进了水稻的根部生长和发育，影响了植物体内营养在根和芽中的分配，定时拍照技术揭示了与内生菌共生的植物优先将营养分配给根部而不是芽部，而根部的发育则有利于植物对氮素的吸收和利用。Mullen等人［12］在美国科罗拉多州的落基山早春雪融时，给Ranunculus adoneus接种未鉴定的深色有隔内生真菌(DSE)，同时加施氮肥，发现接种DSE能提高植物形成的丛枝(AM)菌根菌的比例，并促进新根的发生，进而促进植物对氮素的吸收，因而提出给早春低温地区的作物接种DSE有利于作物对氮素的吸收。

1.1.2 植物内生菌通过生物固氮作用获得更多无机氮素

具有固氮作用的植物内生菌主要是指定殖在植物内部与植物宿主联合固氮的固氮菌［13］。近年来，国内外的研究者先后对不同地域的甘蔗、水稻、黑麦草等禾本科植物中的内生固氮菌进行了分离研究，并且评估了它们的固氮促生能力［14］。除禾本科植物外，还从棕榈树，果树、咖啡树、黑松等林木中也发现了内生固氮菌［14］，其中有些种分布广泛，而有些仅局限于部分地区的部分植物，具有较强的寄主专一性。近年来的文献报道的内生固氮菌有:固氮醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、塞鲁普蒂卡草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)及固氮弧菌(Azoarus)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、固氮螺菌(Azospirillum)、克雷伯氏菌(klebsiella)、芽孢杆菌(Bacillus)、肠杆菌(Enterobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、固氮根瘤菌(Azorhizobium)等属中的一些种［15-21］。

1987年Dobereiner实验室的Lima等人［22］研究证明了甘蔗一生中所需氮素的60%以上是来自生物固氮作用，并在1988年该实验室从甘蔗体内分离到了具有特殊功效的内生固氮菌重氮营养醋杆菌(Acetobacter diazotrophicus)。目前甘蔗内生固氮菌已在巴西等国家广泛应用于甘蔗生产，施用该种内生固氮菌肥能够显著降低氮肥的施用量。最近Thaweenut的研究［23］表明甘蔗内生固氮菌表达的nifH基因与根瘤菌类似。1986年德国的Barbara［24］从巴基斯坦的卡拉草内分离到了固氮弧菌(Azoarcus sp.)，证明了生长在巴基斯坦常年不施任何氮肥的盐碱土中的卡拉草，每年的生物学产量可达到20—40 t/hm2，显然这与固氮弧菌的作用是密切相关的。Adel等人［25］在野生水稻中分离得到内生菌Herbaspirillum sp.B501，并发现该菌有较高的乙炔还原活性，证实了其为水稻内生固氮菌。Ueda等［26］通过扩增nifH基因分析了日本水稻根中的固氮细菌，表明水稻根中存在8个新的nifH类型，有些是从未分离报道过的，它们为水稻提供了相当一部分氮素;Roger等人［27］表明微生物固氮作用(BNF)每年为湿地水稻提供的氮素为50 kg/hm2，固氮螺菌属(Azospirillum)与水稻共生为水稻提供了植物总氮的66%。

目前认为内生固氮菌促进植物氮吸收主要通过其为宿主植物提供无机氮源:内生固氮菌都含有固氮酶，他们以相当高的数量存在植物组织内，几乎可以在宿主植物的各种营养器官内发挥固氮作用，为植物提供无机氮源，而不会引起宿主任何不良反应［16，19］;内生固氮细菌在内根际的固氮则对植物氮含量有直接贡献。有些固氮菌将固定的氮素直接提供给植物吸收同化，有些则将固定大气中的氮气部分提供给宿主吸收利用［28］，其余部分则被细菌转化为细胞氮，由于细菌的生命周期比植物短得多，细菌死亡崩解后释放的氮素也能逐步为植物根系吸收。

1.2 植物内生菌促进宿主对有机氮素的吸收

内生菌侵染植物能分泌多种胞外酶，如漆酶、蛋白水解酶等［29］，这些酶的存在为宿主植物利用有机养分提供了条件。史央等人［30］证实与水稻共生的内生真菌B3能产生漆酶;Addy等人［31］发现DSE可在以鸟嘌呤或尿酸为唯一氮源的培养基上生长，揭示了其对有机氮素的利用。DSE也具有多种胞外酶活性，Bååth等人［32］在一种未鉴定的深色真菌中检测到了纤维素水解酶和蛋白水解酶活性;Ahlich-Schlegel证明［33］DSE具有漆酶、脂肪酶、淀粉酶和多酚氧化酶活性。Upson等人［34］研究发现DSE能在宿主植物的根际周围矿化多肽类物质和一些氨基酸，从而使植物根际更好地利用它们作为氮源。DSE所具有的这些胞外酶活性暗示着其对有机碳、氮、磷的潜在利用能力。另有报道［35］称内生菌处理的植物根际脲酶活性增高，而且有些内生菌自身具有分泌脲酶的能力［36］，这都有利于植物对尿素的利用。

2 植物内生菌促进宿主氮代谢

2.1 植物内生菌影响宿主体内不同形态氮素含量

Lyons等人［5］在研究Neotyphodium coenophialum与高羊茅(Festuca arundinacea)共生时发现内生真菌对感染植株的氮积累和氮代谢有显著的影响。感染植株叶片和叶鞘中的氨浓度均增加，而硝酸盐浓度降低;同时，感染内生菌可显著提高宿主植物体内可溶性氨基酸的总量，特别是谷氨酰胺和天冬酰胺。袁志林等人［37］用内生真菌B3感染水稻后，发现B3可以产生多种游离氨基酸，这些氨基酸可以作为水稻合成激素类物质的前体，从而影响水稻的氮代谢。比如，B3菌株中游离的甲硫氨酸(Met)的含量是水稻叶片中含量的3—15倍，有的水稻品种甚至不含Met，而L-Met是乙烯的生物合成前体。上述植物内生菌影响宿主体内不同形态氮素含量可能是由于内生菌影响了宿主氮代谢关键酶的活性。

2.2 植物内生菌影响宿主体内氮代谢相关酶活性

2.2.1 硝酸还原酶(NR)

在植物氮代谢的过程中，进入体内的硝酸盐在其被同化为氨基酸之前，必须还原成NH3。参与该过程的两种酶是硝酸还原酶和亚硝酸还原酶，前者在细胞质内将还原为，后者在叶绿体内将还原为NH3。硝酸还原酶(NR)是硝态氮同化为氨的过程中的限速酶，该酶可作为植物氮素同化能力强弱的指标［38］。史应武等人［39］发现对甜菜接种内生真菌F11后，显著提高了甜菜硝酸还原酶(NR)的活性;欧阳雪庆等人［40］表明甘蔗内生固氮菌浸种后，甘蔗叶片硝酸还原酶活性明显升高;Broek等人［41］发现固氮螺菌不仅能分泌植物激素，而且能分泌硝酸还原酶，从而促进宿主从土壤中同化氮素，促进植物生长。

2.2.2 谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)

高等植物根部吸收的铵离子或由硝酸盐还原产生的氨，都先形成谷氨酸和天门冬氨酸，氨(NH3)同化过程的主要酶系是谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)和谷氨酸脱氢酶(GDH)［42］。正常氨同化时，GS/GOGAT循环占95%以上，GDH起辅助作用［43-45］，但当体内NH3浓度过高或解除NH3中毒时，GDH作用较大［46-47］。谷氨酰胺合成酶(GS)直接催化谷氨酸与氨发生反应，生成谷氨酰胺。谷氨酰胺合成后，与α-酮戊二酸反应，在谷氨酸合成酶(GOGAT)的作用下，生成谷氨酸。谷氨酸和谷氨酰胺能进一步合成其它酰胺、氨基酸和蛋白质。因此，谷氨酰胺合成酶活性与作物产量有关［48］。谷氨酰胺合成酶(GS)是处于氮代谢中心的多功能酶，它有两种同工酶，分别为定位于胞质和叶绿体的GS1和GS2，执行不同的生理功能。位于叶绿体中的GS2的主要功能是把叶绿体和光呼吸再合成的合成为谷氨酰胺(Gln)［49］，而处在胞质中的GS1则主要是参与根部含氮化合物的合成与运输。

Thomas和Gonzalez等［50-51］证实，GS活性的提高有利于植物氨同化和氮素转化。近几年研究表明，GS/GOGAT途径除了参与氨的初级同化外，还参与叶片中光呼吸释放的氨的再同化和氨基酸、蛋白质的转化等与氨有关的代谢过程。内生菌的感染能提高谷氨酰胺合成酶(GS)的活性，欧阳雪庆等人［40］表明甘蔗接种内生固氮菌对其谷氨酰胺合成酶活性具有普遍而明显的促进作用;史应武等人［39］研究表明，内生真菌F11感染的甜菜，无论是在其根部还是在叶部，GS活性都有显著的提升，从而促进氮素代谢，促进甜菜生长，提高甜菜产量。Lyons等人［5］在研究Neotyphodium coenophialum与高羊茅(Festuca arundinacea)共生时发现内生真菌的感染亦能提高高羊茅体内的谷氨酰胺合成酶活性，从而促进氨的同化，提高植物对土壤氮的利用效率;类似的关于内生菌提高植物谷氨酰胺酶活性的说法在水稻、玉米等作物中均有报道［21，52］，由此可见，内生菌能够通过提高植物谷氨酰胺合成酶活性从而影响植物氮代谢水平。

2.3 植物内生菌对宿主体内氮代谢相关微量生长调节物质的影响

2.3.1 植物内生菌通过产生各种植物激素影响宿主氮代谢

植物内生菌能自身合成或者促进植物合成多种植物生长激素，如生长素(IAA)、细胞分裂素(CTKs)、赤霉素(GA)、乙烯和脱落酸等(ABA)［37，53-56］。Biswas［57］试验表明，外源施加 IAA，可增加种子蛋白质和游离氨基氮含量，促进氮代谢。Hurek等人［58］发现内生菌Azoarcus sp.能够分泌生长素，促进植物发根，使植物根的表面积增加，从而提高植物对氮素等营养物质的摄入量。细胞分裂素(CTKs)与氮素利用关系密切，Beck的研究［59］认为CTKs作为一种信号应答于外源氮素的变化并参与调节植株代谢和发育。Harms［60］发现细胞分裂素(CTK)之一玉米素能明显抑制大豆外植体叶片内N等元素含量水平的下降，特别是N含量。由此可见，内生菌产生的各种植物激素在促进植物氮代谢方面起到了一定的作用。

2.3.2 植物内生菌通过产生多种维生素从而影响宿主氮代谢

维生素是生物体内重要的有机物之一，它作为生物催化剂参与各项重要代谢活动，在植物生长过程中也是必不可少的。王珂等人［8］表明维生素能提高小麦叶片硝酸还原酶的活性，提高小麦根系和叶片的玉米素核苷类ZRs、生长素(IAA)的含量，从而促进根系发育和分支根的形成，这无疑对氮素的吸收和同化是有利的。微生物在代谢过程中会产生多种水溶性维生素，如VB1、VB2、VB6等。袁志林等人［37］发现内生菌侵染水稻后能产生VB1;周德平等人［61］表明内生真菌感染兰花后能产生VB6的前体PABA和VB1。由此可见，内生菌可能通过产生维生素类物质影响植物氮代谢。

3 植物内生菌通过调节宿主氮吸收与代谢从而影响宿主生长发育

3.1 植物内生菌通过影响植物氮代谢从而促进宿主分蘖

分蘖是水稻等禾谷类作物最重要的农艺性状之一，它直接决定着水稻穗数的多少并进而影响水稻单位面积的产量［48］。植物分蘖受氮素水平的显著影响，丁艳锋等［62］认为外界氮素通过影响植株氮营养调节分蘖发生，某节位分蘖能否发生与叶片、叶鞘含氮率密切相关。氮能促进水稻分蘖，稻苗含氮量在2.5%以下，分孽生长停止，含氮量超过3.0%—3.5% 时，分孽才能迅速进行［63］。Gregory等人［64］发现内生真菌感染黑麦草(Lolium perenne)后可增加其分蘖数;史央等人［30］研究发现内生真菌B3与水稻共生后能促进水稻分蘖;Belesky和Fedders［65］表明内生菌侵染高羊茅(Festuca arundinacea)后，通过同化更多的营养用于植物分蘖。内生菌可能通过提高植物的氮素水平进而促进植物分蘖。

3.2 植物内生菌提高宿主体内叶绿素含量和光合速率

植物光合作用与植物氮代谢关系十分密切。氮代谢需要植物光合作用提供碳源和能量，而光合作用又需要氮代谢提供酶蛋白和光合色素，二者需要共同的还原力、ATP和碳骨架［66］。核酮糖二磷酸羧化加氧酶(Rubisco)是1，5-二磷酸核酮糖和CO2生成二分子3-磷酸甘油酸反应的酶，该酶在植物中的含量非常丰富，大约占总可溶性蛋白的一半。Rubisco也与氮的利用相关，它既是光合作用的限速因子，又是氮素代谢的关键酶之一［67］。

有研究表明［68］，在光照充足的条件下，叶片含氮量与光合作用能力成正相关，其最直接的原因是卡尔文循环和类囊体所含的蛋白质占据叶蛋白质的绝大部分，叶片含氮量的增加使Rubisco的绝对量和相对量增加，而其他的光合组分(如细胞色素f)的相对含量不变［69］。Chaintreuil等人［70］发现水稻内有一种具有光合作用能力的内生菌，并且它也被证实是豆荚茎瘤中固氮菌的一个株系;李霞等［71-72］研究表明内生真菌B3侵染水稻后，可以提高水稻的光合速率，有利于维持植物的光合作用能力;史央等人［30］证明内生真菌B3的侵染可以提高宿主水稻体内的叶绿素含量，叶绿素是重要的蛋白质类物质，其含量的增加预示着植物体内氮代谢的提升，合成了更多的含氮物质，同时也提高了植物光合作用的水平。

4 总结与展望

内生菌与植物共生关系是一种古老的生物之间的互作方式，影响二者共生关系的因素有很多，有环境因素(如土壤类型和营养条件)、内生菌与宿主植物的基因型和宿主的生长发育阶段等［73-74］，虽然内生菌的存在对于植物高效吸收利用氮素起着重要的作用，但是其内在机制仍不清楚。现有的文献报道多是从生理水平概述了内生菌对植物氮吸收、氮代谢的促进，目前的研究尚停留在内生菌提高植物氮代谢相关酶活性的表观阶段，未发现有报道对其内在机理作出详细阐述。内生菌改变宿主氮代谢除了涉及氮素同化和基础代谢外，可能还与内生菌菌体在体外条件下对氮素利用的机制有关，有的内生真菌能够在体外培养条件下利用和作为氮源，而有的只能利用作为氮源而不能利用［75-76］。关于内生菌提高宿主氮素利用率是由内生菌产生的酶的直接作用或是内生菌间接刺激宿主相关酶表达的间接作用现在仍不可知［77］。

内生菌与植物共生后，可能是产生某种信号，植物体接受该信号后，能够刺激氮代谢相关酶基因的选择性高效表达，使酶活性升高，从而使植物氮代谢加强。随着基因组学、蛋白质组学和微生物分子生物学技术的日趋成熟，最近也出现了关于内生菌提高植物抗性基因表达的报道，比如，Sun等人［78］的研究表明内生菌在甘蓝体内定殖后，会促进甘蓝叶片中抗旱相关基因的表达，并提高抗旱相关蛋白的表达，从而赋予甘蓝更强的抗旱能力;Ownley等人［79］发现内生菌的侵染能增强植物抗病基因的表达，这些研究手段将能更加深入的揭示内生菌促进植物氮代谢的机制。综观已有的研究进展和存在的问题，作者认为今后的研究应着重从以下3个方面进行研究验证:(1)内生菌的侵染会使植物体内氮素利用相关基因的高效表达，从而促进植物氮代谢;(2)内生菌的侵染会增强宿主体内氮吸收相关基因的表达，如铵盐转运蛋白基因及硝酸盐转运蛋白基因的表达，从而提高宿主植物对氮素的运输和再利用。(3)内生菌对植物根际土壤微生物群落结构的影响，内生菌的存在能使根际土壤的氮代谢相关微生物数量增多，如氨氧化细菌、氨氧化古菌、固氮菌等。

随着研究的深入，植物内生菌对植物氮吸收、氮代谢的促进机制将会更加清晰，植物内生菌用于农业生产从而代替氮肥的施用，从而减轻过量氮肥使用带来的环境破坏起到重要作用。所以，植物内生菌促进植物氮吸收与氮代谢具有重要的研究价值。

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