植物中特定果聚糖的合成研究进展

戴晓丽

(青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042)

山东省自然科学基金资助项目(Q2006B02) 收稿日期：2013-08-20

作者简介：戴晓丽(1989-)，女，山东即墨人，硕士研究生，研究方向：药物化学,E-mail:dxlqust@163.com。

doi

：10.3969/j.issn.1672-5425.2013.12.004

植物中特定果聚糖的合成研究进展

戴晓丽

(青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042)

果聚糖，是由多种细菌和植物产生的一种果糖聚合物，是重要的存储碳水化合物;菊苣是一种商业果聚糖生产作物。果聚糖在菊苣体内的生物合成是难以控制的。特定果聚糖是原本非果聚糖积累植物引进果糖基转移酶基因的成功表达。较为系统地综述了果聚糖的生物合成及修改、特定果聚糖的合成、果聚糖的功能及应用等方面的研究进展。

果聚糖；植物；菊苣；果糖基转移酶；转基因

果聚糖是由果糖单元和葡萄糖残基末端组成的聚合物，广泛存在于生物有机体(细菌、某些真菌和约15%的被子植物)中。按糖苷键的连接类型果聚糖可划分为3类：通过β(2-6)键连接的聚糖型果聚糖，主要存在于细菌和单子叶植物中[1]；通过β(2-1)键连接的线性菊糖型果聚糖，存在于双子叶植物中[2]；通过线性β(2-1)键连接的果糖基单元连接到蔗糖葡萄糖部分的C1和C6位而成的果聚糖新生混合系列，存在于百合科[3]中。

细菌利用果聚糖作为能量储存分子[4]和细胞保护层。植物病原细菌利用果聚糖层来阻断宿主-病原体识别和抑制衰竭的植物细胞释放的抑菌化合物[5]。口腔中的链球菌利用果聚糖层作为粘接剂。果聚糖在细菌中的生物合成是由单一酶果糖基转移酶(Fructosyl-transferase,EC2.4.1.10)完成的。在植物中，果聚糖作为一类重要的碳水化合物和渗透调节物质，被存储在茎、块茎或根中，在提高植物的抗寒、抗旱乃至抗盐性能等方面发挥着重要作用[6]。由于果聚糖生产植物的遗传多样性，植物果聚糖链长变化范围约为10～200个果糖基单元。与细菌果聚糖生物合成的单一性相比，植物果聚糖的生物合成由3种不同酶参与：蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶(Sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase,1-SST，EC 2.4.1.99)、果聚糖：果聚糖-1-果糖基转移酶(Fructan:fructan 1-fructosyltransferase,1-FFT，EC2.4.1.100)和果聚糖外水解酶(Fructan exohydrolase,1-FEH，EC3.2.1.153)。1-SST主要催化两分子的蔗糖生成等摩尔的1-蔗果三糖(1-Kestose)；1-FFT催化1-蔗果三糖的果糖单元和其它果聚糖分子转化成1-蔗果三糖和较高聚合度(DP)果聚糖分子，当使用最短的果聚糖1-蔗果三糖作为果聚糖供体时，1-FFT可以提高平均聚合度(mDP)；1-FEH通过水解果聚糖单元末端催化菊糖降解,形成果聚糖和低聚合度菊糖[7]。

1 菊苣中果聚糖的生物合成

菊苣是一种商业化生产菊糖的作物，菊糖被储存在其主根中，其质量的重要参数之一是聚合物的长度。菊苣在春季播种，并在同年秋天收获主根并提取菊糖。收获时，菊糖聚合物的平均长度为9～10，每公顷的平均产量为11 000 kg 碳水化合物。播种7周后伴随着果聚糖合成酶1-SST和1-FFT的诱导活性，主根开始增厚。1-SST的活性迅速升高，3周后达到最高[8]。播种10周后活性开始下降，直到11月的生长季只剩下10%的活性。1-FFT的活性呈现不同的模式，开始时缓慢上升，于4周后达到稳定[9]。首月由于果糖基转移酶的活性主要形成短菊糖，播种9周后菊糖分子累积聚合度达到25。Druart等[8]发现，菊糖的mDP在9月初达到最大值(约为16)后开始降低。van den Ende等[9]认为，mDP下降的原因是在1-SST存在时，1-FFT催化下传入的蔗糖作为果糖单元的受主。在低温季节(10月中旬)，由于FEH-I的果聚糖外水解酶活性，mDP进一步下降[10]。当温度低于4 ℃时，可诱导FEH-Ⅱ增强菊糖的降解。1-FFT和1-FEH在秋季的降解催化对工业菊糖的生产是很不利的，尤其是对高聚合度菊糖的生产。从菊苣菊糖生物合成的研究可以得出结论：1-SST活性下降和1-FEH活性升高都会对mDP产生不利影响。为生产高聚合度、高产量的菊糖或改变果聚糖连接型，菊苣中果聚糖合成的修改得到了广泛关注。

2 果聚糖生物合成的修改

2.1为得到较高mDP和产量，菊苣中果聚糖生物合成的修改

提高菊苣菊糖mDP的方法主要有两种：(1)阻止在生长季节末期1-SST活性的降低。在生长季节内源性酶1-SST活性下降，为此Koops等[11]从菊芋中分离出两种不同的1-sst基因(sst-Ⅰ和sst-Ⅱ)在CAMV-35S启动子控制下得到表达。为了研究引入基因的效果，含有一个额外的1-sst基因的植物在类似条件下培育生长。野生菊苣内1-SST活性降低和通过1-FFT对蔗糖的果糖基转移酶活性的作用通常发生在9～11月，对这段时期的菊糖mDP和1-SST、1-FFT、1-FEH的活性进行了监测。比较控制植物与含有菊芋sst-Ⅱ基因的植物发现，转基因对1-SST总活性有着显著的贡献。在实验第8周，这种额外的1-SST活性导致mDP上升20%。但是，含有sst-Ⅰ基因的植物并没有呈现出较高水平的1-SST活性，也没有表现出mDP的显著改变。然而低温下，这两种类型的转基因植物(含有sst-Ⅰ或sst-Ⅱ)和野生植物产生相似的mDP降低的影响，在生长季节结束时未生成较长链的果聚糖，最有可能是因为实验结束时低温下FEH的诱导。(2)降低1-FEH活性以提高菊苣菊糖在收获时的mDP。如将组成型CAMV-35S启动子驱动的FEH-Ⅰ反义片段插入菊苣基因组中。但是在进行转基因冷处理特别是诱导FEH-Ⅰ时，对mDP只有轻微的影响，可能的解释是，剩下的feh-Ⅰ导致足够的1-FEH活性来降低mDP。

2.2为改变果聚糖类型，菊苣中果聚糖生物合成的修改

Sprenger等将大麦中蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(Sucrose:fructan 6-fructosyltransferase,6-SFT)引入到菊苣中，以生产混合型果聚糖，发现转基因植物主根中的菊糖组合物并没有改变。然而，放置在蔗糖溶液中的菊苣叶切片在光照下连续积累β(2-1)菊糖和β(2-6)果聚糖证明了菊苣中大麦6-SFT的功能性；延长光照后，转基因叶片中的大多数果聚糖是菊糖型，只有一小部分含有混合型果聚糖。原因可能是1-FFT对底物的竞争胜过异源6-SFT。这种对底物的竞争也可能是主根中混合型果聚糖存在的原因，并可能由于6-sft比内源性1-fft有较低的表达或是1-FFT对底物有较高的亲和力。另外，Vijn等[12]将洋葱编码基因6G-FFT引入到菊苣中。总之，为了提高mDP或改变果聚糖类型，修改菊苣中菊糖代谢的尝试方法包括额外基因的转入和外水解酶基因的抑制。虽然转入基因具有功能性并且在转基因植物中可检测到基因抑制，但在mDP和菊糖组成上只有很少的预期效果。强启动子可以用于驱动外源基因的表达，例如菊苣中的1-fft启动子；为了阻止外水解酶的活性，3个feh基因(feh-Ⅰa、feh-b、feh-Ⅱ)可能需要被抑制，最好使用更有效的基因沉默技术，如RNA干扰(RNAi)、敲除突变体等。

2.3 其它植物中果聚糖生物合成的修改

枯草芽孢杆菌的sacB基因在黑麦草中表达的研究表明，果聚糖在植物中的积累干扰了果聚糖的天然结构。天然的高聚合度果聚糖被耗尽，而较低聚合度果聚糖的结构发生了改变[13]。将从大麦中提取到的6-gff或1-sst在黑麦草中表达，得到了比野生型植株中多15%的果聚糖，表明在不损害植物生长的情况下增加了果聚糖含量[14]。Sobobel等[15]发现大肠杆菌天冬酰胺合成酶在转基因莴苣中过度表达累积的果聚糖是野生植物累积的30倍。

上述研究显示，天然果聚糖的组成可以在转基因植物中被显著改变，对果聚糖产量和组成的影响比早期的转基因菊苣更为明显。

3 特定果聚糖的合成

特定果聚糖，即具有所需链长度和连接型的果聚糖，主要依赖于适当基因的选择。Koops等[11]采用转基因甜菜作为特定果聚糖的事例证明1-sst基因和1-fft基因的不同组合产生具有不同菊糖类型的甜菜转化体。将洋葱的1-sst和6-gff成功转入甜菜中也可获得特定分支的果聚糖[16]。除了用于生物合成的基因源，可用的底物和与其它碳水化合物的生物合成途径的竞争对果聚糖的积累也是很重要的。

3.1 蔗糖的可用性决定了果聚糖产量

宿主作物是非常重要的产率影响因素。马铃薯与甜菜相比都具有相同的菊芋1-sst基因，但产量差距很大，相比马铃薯，甜菜积累了50倍以上的菊糖[17，18]。同样，相比淀粉积累品种，淀粉缺乏的玉米可以累积60倍的菊糖而得到更高产率。基于甜菜和淀粉缺乏玉米都可以积累较高产率的蔗糖，可以得出结论，蔗糖可用性是这些转基因植物中果聚糖产量的决定性因素。

3.2 果聚糖积累与淀粉的竞争

许多果聚糖积累的平台植物也可生产淀粉，碳水化合物的合成途径与果聚糖的生物合成使用相同的底物，可能具有竞争性。对存储蔗糖的转基因淀粉缺乏玉米的果聚糖积累量和转基因淀粉积累玉米的果聚糖积累量进行比较时，相同的果糖基转移酶基因得以表达，转基因淀粉缺乏玉米积累的果聚糖为20 mg·gFW-1，转基因淀粉积累玉米产量较前者少60倍[17]。在马铃薯作为宿主生产果聚糖的研究中，Caimi等[19]报道了减少淀粉量的情况，说明了种子质量的大幅减少和淀粉含量的减少，主要是由于蔗糖合成酶和蔗糖SacB蛋白质之间的竞争。从这些研究中可以得出结论,淀粉积累作物生产果聚糖时，淀粉生产和果聚糖的生物合成对蔗糖的竞争，会影响两者或其中之一的存储碳水化合物的合成，也不利于在平台作物上生产果聚糖。

3.3 生产特定果聚糖的平台作物

优良的适合果聚糖生产的平台作物是高产率、拥有大存储器官积累蔗糖并只有很少或根本没有淀粉产生的植物，并且具有可用的原料提取处理链。甜菜能够积累高浓度的蔗糖(200 mg·gKW-1)，产率为10～14 t·hm-2，生产提取过程可参照菊苣菊糖，是一种成功的果聚糖生产平台作物[11,16,18]。另一种潜在的强大平台作物是甘蔗，具有较高的蔗糖含量(成熟茎节500 mg·gDW-1[20])和完善的畜牧业加工链，产率(6～14 t·hm-2)与甜菜相近。Nicholson[21]成功地在甘蔗中引进了朝鲜蓟的1-SST，可在相似条件下生产1-蔗果三糖，但产量(112 nmol·gFW-1)较转基因甜菜低1000倍。水稻也被证明能够表达1-sst和6-sft基因，表达1-sst的转基因水稻在叶片中能累积达16 mg·gFW-1的果聚糖[22]。虽然相比之下转基因水稻的果聚糖浓度较低，但是可以在原本无用的水稻叶中生产果聚糖，提高了利用价值。综上所述，果聚糖生产最具潜力的平台作物是甜菜和甘蔗，其次是水稻。

4 结语

多种细菌和植物果糖基转移酶基因已被转入许多不同的植物中，如单子叶植物(水稻、玉米、甘蔗等)、双子叶植物(马铃薯、甜菜等)。果聚糖合成的修改或基因转入效果主要参照果聚糖的产率、聚合物的长度和果聚糖连接型的改变。新平台作物相比菊苣的生产水平(11 t菊糖·hm-2)可能还不具备竞争性，然而它们具有一定的优点，为特定果聚糖的生产提供了良好的起点。甜菜、甘蔗和水稻是最具潜力的生产平台作物。迄今为止，多种基因已从不同物种中分离用于生产特定果聚糖。总之，在平台作物中合成特定果聚糖的许多可能性是存在的，而且有些已被证实。

[1] Bonnett G D,Sims I M,Simpson R J,et al.Structural diversity of fructan in relation to the taxonomy of thePoaceae[J].New Phytologist,1997,136(1):11-17.

[2] Koops A J,Jonker H H.Purification and characterization of the enzymes of fructan biosynthesis in tubers ofHelianthustuberosusColombia(Ⅱ.Purification of sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase and reconstitution of fructan synthesisinvitrowith purified sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase and fructan:fructan 1-fructosyltransferase)[J].Plant Physiology,1996,110(4):1167-1175.

[3] Pollock C J.Tansley review No.5.Fructans and the metabolism of sucrose in vascular plants[J].New Phytologist,1986,104(1):1-24.

[4] Burne R A,Chen Y Y M,Wexler D L,et al.Cariogenicity ofStr-

eptococcusmutans strains with defects in fructan metabolism assessed in a program-fed specific-pathogen-free rat model[J].Journal of Dental Research,1996,75(8):1572-1577.

[5] Kasapis S,Morris E R,Gross M,et al.Solution properties of levan polysaccharide fromPseudomonassyringaepv.phaseolicola,and its possible primary role as a blocker of recognition during pathogenesis[J].Carbohydrate Polymers,1994,23(1):55-64.

[6] 李慧娟,孙建全,李俊峰.高等植物果聚糖合成途径、相关基因和功能的研究进展[J].中国农学通报，2007,23(9):186-191.

[7] van den Ende W,Michiels A,van Wonterghem D,et al.Cloning,developmental,and tissue-specific expression of sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase fromTaraxacumofficinale.Fructan localization in roots[J].Plant Physiology,2000,123(1):71-80.

[8] Druart N,De Roover J,van den Ende W,et al.Sucrose assimilation during early developmental stages of chicory (CichoriumintybusL.) plants[J].Planta,2001,212(3):436-443.

[9] van den Ende W,Michiels A,De Roover J,et al.Fructan biosynthetic and breakdown enzymes in dicots evolved from different invertases.Expression of fructan genes throughout chicory development[J].Scientific World Journal,2002,2(5):1281-1295.

[10] Michiels A,van Laere A,van den Ende W,et al.Expression analysis of a chicory fructan 1-exohydrolase gene reveals complex regulation by cold[J].Journal of Experimental Botany,2004,55(401):1325-1333.

[11] Koops A J,Sevenier R,van Tunen A J,et al.Transgenic plants presenting a modified inulin producing profile[P].USP 6 664 444,2003-11-16.

[12] Vijn I,van Dijken A,Sprenger N,et al.Fructan of the inulin neoseries is synthesized in transgenic chicory plants(CichoriumintybusL.) harbouring onion(AlliumcepaL.) fructan:fructan 6G-fructosyltransferase[J].Plant Journal,1997,11(3):387-398.

[13] Ye X,Wu X,Zhao H,et al.Altered fructan accumulation in tra-

nsgenicLoliummultiflorumplants expressing aBacillussubtilissacBgene[J].Plant Cell Reports,2001,20(3):205-212.

[14] Hisano H,Kanazawa A,Kawakami A,et al.Transgenic perennial ryegrass plants expressing wheat fructosyltransferase genes accumulate increased amounts of fructan and acquire increased tolerance on a cellular level to freezing[J].Plant Science,2004,167(4):861-868.

[15] Sobobel A P,Segre A L,Giannino D,et al.Strong increase of foliar inulin occurs in transgenic lettuce plants (LactucasativaL.) overexpressing the Asparagine Synthetase A gene fromEscherichiacoli[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(26):10827-10831.

[16] Weyens G,Ritsema T,van Dun K,et al.Production of tailorma-

de fructans in sugar beet by expression of onion fructosyltransferase genes[J].Plant Biotechnology Journal,2004,2(4):321-327.

[17] Stoop J M,van Arkel J,Hakkert J C,et al.Developmental modulation of inulin accumulation in storage organs of transgenic maize and transgenic potato[J].Plant Science,2007,173(2):172-181.

[18] Sevenier R,Hall R D,van der Meer I M,et al.High level fructan accumulation in a transgenic sugar beet[J].Nature Biotechnology,1998,16(9):843-846.

[19] Caimi P G,McCole L M,Klein T M,et al.Cytosolic expression of theBacillusamyloliquefaciensSacBprotein inhibits tissue development in transgenic tobacco and potato[J].New Phytologist,1997,136(1):19-28.

[20] Glassop D,Ryan L P,Bonnett G D,et al.The complement of soluble sugars in theSaccharumcomplex[J].Tropical Plant Biology,2010,3(2):110-122.

[21] Nicholson T L.Carbon turnover and sucrose metabolism in the culm of transgenic sugarcane producing 1-kestose[D].University of Stellenbosch and Information Service,2007.

[22] Kawakami A,Sato Y,Yoshida M.Genetic engineering of rice capable of synthesizing fructans and enhancing chilling tolerance[J].Journal of Experimental Botany,2008,59(4):793-802.

RecentAdvancesofTailor-MadeFructanSynthesisinPlants

DAI Xiao-li

(CollegeofChemicalEngineering,QingdaoUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266042,China)

Fructan,a fructose polymer,is produced by many bacteria and plants and used as carbohydrate reserve.Chicory is a commercial fructan producing crop.Studies using genetically modification showed that fructan biosynthesis is difficult to steer in chicory.Alternatives for production of tailor-made fructan,fructan with a desired polymer length and linkage type,are originally nonfructanaccumulating plants expressing introduced fructosyltransferase genes.Fructan biosynthesis and its modification,synthesis of tailor-made fructan,and function and utilization of fructan were briefly reviewed in the article.

fructan;plant;chicory;fructosyltransferase;genetic modification

Q 943.2

A

1672-5425(2013)12-0014-04