病原细菌多糖疫苗和多糖结合疫苗研究进展

潘超，朱力，王恒樑

军事医学科学院 生物工程研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071

由病原微生物引起的传染病是人类患病的主要因素，其中以婴幼儿和老人感染最为严重，尤其在发展中国家这种状况更加明显，这其中包括一些重要的病原菌如肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、流感嗜血杆菌、沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌等[1]。1923年Heide⁃berger等提出肺炎链球菌中血清型的不同主要由多糖决定，之后又证实皮下注射肺炎链球菌荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）能够诱导机体产生保护性抗体，进而利用这种多糖开发出针对肺炎的疫苗[2]。随着抗生素的使用，病原细菌感染的状况在一段时间内得到极大的改善，使病原细菌的疫苗研究一度相对受到冷落。但抗生素滥用导致细菌耐药性的出现，病原细菌的防治又成为令人头疼的世界性难题。于是，包括多糖及多糖结合疫苗在内的各类细菌性疫苗的研制又重新引起了人们极大的兴趣。

1 多糖疫苗

细菌中存在多种糖类物质，它们在细菌的识别、信号传递、黏附、感染及防御等方面发挥着重要作用，其中与致病性相关的包括CPS及脂多糖（lipo⁃polysaccharide，LPS）中 的 O 抗 原 多 糖（O-antigen polysaccharide，O-PS）等。CPS是细胞荚膜的主要成分，可作为屏障保护菌体免受外界不利环境影响。O-PS由重复寡糖单位组成，是脂多糖主要的致病因子，可帮助致病菌逃避宿主免疫系统的识别[3]。对大多数致病菌而言，CPS和O-PS具有免疫原性，可刺激机体产生保护性抗体。这些多糖均属于2型T细胞非依赖抗原（T cell-independent type 2，TI-2），进入机体后，通过与B细胞表面的抗原识别受体即表面免疫球蛋白分子（surface immunoglobulin mole⁃cules，sIg）交联而激活B细胞，引起一系列下游变化，使B细胞分化为可分泌抗体的浆细胞，在整个免疫过程中并没有T细胞的参与，因此不会形成免疫记忆，产生的抗体主要是亲和力较低的IgM和IgG2[4-5]。

由于多糖的免疫原性，可将其制成多糖疫苗，主要是将特异性的多糖纯化后制备而成。但由于多糖分子的大小决定了免疫强度的大小，某些病原菌的O-PS及低分子质量的CPS（如金黄色葡萄球菌CPS）作为疫苗的效果并不理想[1]。目前临床上有3种荚膜多糖疫苗被广泛使用，b型流感嗜血杆菌（Hae⁃mophilus influenzae type b，Hib）多糖在 Hib结合疫苗出现之前也有短期应用。

1.1 伤寒Vi多糖疫苗

伤寒Vi多糖疫苗是最简单的多糖疫苗，主要利用沉淀法将Vi多糖沉淀，以乳糖作为稳定剂。这种提取多糖的方法较温和，可保持其原有结构[6]。在临床试验中，疫苗的有效率约70%，其效果与之前使用的全菌疫苗一样，但它引起的副作用却明显降低[7]。

1.2 脑膜炎奈瑟球菌CPS疫苗

脑膜炎奈瑟球菌CPS疫苗是从可引起人类疾病的特异性血清型脑膜炎奈瑟球菌中纯化的对热稳定的多糖，通过将不同血清型的多糖组合，形成了二价（A、C群）、三价（A、C、Y群）、四价（A、C、Y、W-135群）等多种多糖疫苗。上世纪60年代首次应用于美国军队[8]，目前已广泛应用于旅游者等易感人群，但主要针对的是2岁以上儿童及成人。

1.3 肺炎链球菌CPS疫苗

目前使用的肺炎链球菌CPS疫苗是包含23种血清型（1、2、3、4、5、6b、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17、18C、19F、19A、20、22、23F 和 33F）的特异性多糖[9]，可有效预防老年人肺炎，具有良好的安全性，免疫后保护作用可维持5年左右，但也有统计数据表明对高危老年人的免疫效果不理想[10]。Musher等[11]认为，由于存在遗传因素的影响，导致该疫苗接种者对其中一些血清型并不产生免疫反应。

1.4 Hib CPS疫苗

Hib CPS疫苗主要成分为菌体荚膜中的多糖或多磷酸聚核糖基核糖醇（polyri-bosylribitol phos⁃phate，PRP）。1985年4月Hib多糖疫苗在美国上市，主要适用于2～5岁的儿童[12]。虽然这种采用PRP的多糖疫苗对于成人和年龄较大的儿童有很好的保护作用，但对小于18月龄的婴幼儿实际有效率为零，而流行病学调查表明6个月龄婴儿就需要相应的保护，这是该疫苗使用上的最大障碍。

总之，多糖属于TI-2抗原，由于婴幼儿免疫系统尚未发育完全，因此这种疫苗对2岁以下婴幼儿基本无效，但这些人群却最易受到病原细菌的感染。对于2岁以上人群，由于无记忆细胞，无法产生长久的保护作用，也需要多次免疫来维持抗体水平。尽管多糖疫苗在应用上有一定的限制，但由于经济性[13-14]和良好的安全性，一些多糖疫苗在人群中依然被广泛使用。

2 多糖结合疫苗

早期动物试验证明，当多糖连接上蛋白后可以加强其免疫原性[15]。考虑到多糖疫苗免疫效果不佳和抗生素滥用导致的耐药性的出现，人们又提出了多糖结合疫苗，即将细菌的聚糖共价连接到适当的蛋白载体上形成糖蛋白，从而产生长久的免疫保护效果。糖蛋白属于T细胞依赖抗原（T cell-depen⁃dent，TD），当抗原进入体内，其中的多糖部分被B细胞表面的sIg识别[16]，随后糖蛋白被内吞；同时蛋白部分被蛋白酶降解，其中一些肽链被第Ⅱ类主要组织相容性复合体（MHC-Ⅱ）识别后呈递到细胞表面；而后，肽-MHC-Ⅱ复合物被T细胞识别，最终T细胞通过直接与细胞表面蛋白相互作用及细胞因子的信号通路，促进B细胞分化成熟为浆细胞并产生记忆B细胞。整个过程中抗原并未与sIg产生交联，因此较短的糖链依然可产生有效的免疫反应[17-18]。这种免疫机制与多糖疫苗引起的免疫机制完全不同，不仅能刺激机体产生非T细胞依赖免疫反应，还能引起T细胞依赖免疫反应，产生长久的免疫效果，因此多糖结合疫苗被认为是人类最成功的疫苗[19]。

目前，糖蛋白的形成主要有2种方法，一种是化学交联法，另一种是生物合成法。

2.1 化学交联法

化学交联是指CPS或O-PS通过化学方法共价连接到载体蛋白。首先从病原菌中得到具有免疫原性的多糖，从工程菌中得到载体蛋白，将多糖和载体蛋白活化，再通过化学反应将二者共价连接，即得到糖蛋白结合疫苗。目前已应用于临床的化学交联法生产的多糖结合疫苗包括针对Hib、肺炎链球菌及脑膜炎奈瑟菌的多糖结合疫苗。

2.1.1 Hib多糖结合疫苗 1987年，Anderson等参与完成的第一个针对Hib的多糖结合疫苗被批准临床使用。该疫苗主要利用高碘酸盐活化荚膜多糖，通过还原胺化作用分别与白喉类毒素和白喉类毒素无毒突变体（cross-reacting material 197，CRM197）相连制成，临床试验表明，这种疫苗连续接种2次后IgG含量明显升高[20]。此外，对于婴儿，多糖结合疫苗中寡糖单位重复的数目对疫苗免疫原性有重要影响，20个寡糖重复单位的结合疫苗比8个寡糖重复单位的结合疫苗更容易产生多糖抗体，这种区别在成人中并不明显[21]。Hilleman等[22]用溴化氰（CNBr）或水溶性碳化二亚胺将聚糖活化后，通过连接体六氨基己酸与载体蛋白（如脑膜炎奈瑟球菌B群Ⅱ型蛋白和破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT））相连。动物实验和临床实验均表明这种疫苗具有很好的免疫原性，8个月儿童可产生高滴度多糖抗体。1990年Donnelly等[23]将PRP多糖连接到脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白（outer membrane protein complex，OMPC）所生产的结合疫苗具有很好的免疫原性。Schlesinger等[24]将分别与CRM197、TT和脑膜炎奈瑟球菌OMPC连接的多糖结合疫苗Oligo-CRM、PRP-TT和PRP-OMPC多次免疫婴儿，发现虽然3种疫苗均可产生有效的保护作用，但PRP-OMPC疫苗的抗体亲和力明显低于前2种疫苗。

2.1.2 脑膜炎奈瑟球菌多糖结合疫苗 自1999年针对脑膜炎奈瑟球菌C群的多糖结合疫苗在英国首次使用以来，脑膜炎发病率明显降低[25]。之后，该疫苗在欧洲其他国家及加拿大等国相继获准上市。2005年，Sanofi Pasteur公司生产的脑膜炎奈瑟球菌结合疫苗Menactra在美国上市，它以白喉类毒素为载体蛋白，与4种不同血清型（A、C、W-135和Y群）多糖相连。Granoff等[26]研究了这种疫苗对机体保护的持续时间，发现Menactra免疫后3年对76%的受试者仍具有保护作用，而多糖疫苗只有49%。2010年，Novartis公司生产的疫苗Menveo获准上市，这种疫苗以CRM197为载体蛋白，含有A、C、W-135和Y等4种血清型多糖。Gill等[27]对Menactra和Menveo的效果进行了比较，发现在11～18岁人群中一次注射2种疫苗22个月后均可产生免疫保护，但后者的血清杀菌活性明显高于前者。2012年6月14日，美国FDA又批准了针对脑膜炎奈瑟球菌C、Y血清型和Hib的重组疫苗Menhibrix，这是第一个可用于6岁婴儿的脑膜炎奈瑟球菌疫苗。虽然B血清型同样引起严重疾病，但由于B型中的多糖与中枢神经系统抗原相似[28]，不能引起有效的免疫反应，因此多价脑膜炎奈瑟球菌多糖结合疫苗中并无B型多糖。

2.1.3 肺炎球菌多糖结合疫苗 2000年，七价肺炎球菌多糖结合疫苗在美国上市，由惠氏公司研制，通过肺炎球菌CPS结合到蛋白载体CRM197制成。同时，Black等[29]通过临床试验证明七价肺炎链球菌结合疫苗对于儿童感染的预防具有很好的效果，而对于多糖疫苗不敏感的人群，使用多糖结合疫苗后可产生有效的免疫保护。目前七价肺炎链球菌结合疫苗已在全球100多个国家上市，通过结合疫苗的使用，肺炎发病率得到了很好的控制。

除上述已上市的通过化学交联法生产的多糖结合疫苗外，还有其他一些结合疫苗正在研制中，如甲型副伤寒结合疫苗。Szu等[30]利用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸（CDAP）和CNBr活化的多糖连接到TT得到相应糖蛋白，其中后者可产生高水平的多糖IgG抗体，目前正在进行临床试验。

化学交联方法生产的多糖结合疫苗可以产生记忆细胞，保持对病原体长久的免疫力，同时又可用于2岁以下婴幼儿，有效克服了多糖疫苗的不足。但利用化学交联方法生产疫苗需要对底物蛋白、多糖分别纯化，活化后交联，再进行第三次纯化。由于纯化工艺等的限制，多次纯化后回收率明显降低，从而造成资源浪费，再加上疫苗纯度的要求，成本大大提高，价格随之升高，很难在发展中国家及贫困国家推广。此外，由于化学交联的随机性，使得最终产物的均一性不高。因此，结合疫苗的生产需要不断改进工艺或探寻新的方法。

2.2 生物合成法

在很长一段时间内，人们一直认为蛋白糖基化只存在于真核生物中。自从1974年Mescher首次发现细菌中存在糖蛋白及糖基化修饰以来[31]，在原核、真核、古生菌等所有生命领域均发现蛋白糖基化的存在[32]，目前已报道的具有糖蛋白的细菌已超过70种[33]。蛋白糖基化包括O糖基化和N糖基化，细菌中大多为O糖基化，只在仅有的几种菌中发现N糖基化，其中研究最为透彻的是空肠弯曲杆菌N糖基化。空肠弯曲杆菌中的N糖基化主要由关键的糖基转移酶PglB催化，其结构与真核生物糖基转移酶OST的保守催化亚基Stt3p相似，可催化空肠弯曲杆菌糖链转移至底物蛋白AcrA。2002年，Wacker等[34]首次将空肠弯曲杆菌N糖基化相关基因pglB及acrA通过载体转移至大肠杆菌，使AcrA发生糖基化，证明单独存在的PglB就可以催化底物蛋白AcrA发生糖基化；进一步研究发现PglB具有宽松的底物特异性[35]，可以使多种聚糖转移至底物蛋白，但多糖还原端须为N-乙酰半乳糖或葡糖胺（HexNAc）[36]。底物蛋白糖基化位点也不同于真核中的保守三肽结构NXS/T，而是D/EYNXS/T的五肽结构[37]。

脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL可单独催化脑膜炎奈瑟球菌Ⅳ型菌毛蛋白PilE发生O糖基化。2007年Faridmoayer等[38]将pglL转移至大肠杆菌且在PglL催化下使脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白在大肠杆菌中发生了O糖基化。同PglB一样，PglL可单独完成催化功能。与PglB相比，PglL具有更加宽松的底物特异性，可以转移更多的聚糖[39]。此外，绿脓杆菌O糖基化系统也已被转移至大肠杆菌[38]，但糖基转移酶PilO只能转移短糖链[19]。除了以上3种糖基化系统通过基因工程技术被转移至大肠杆菌外，铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌等微生物糖基化机制也正在深入研究中[40]。

微生物糖基化过程与细菌LPS合成相似[41]，均需要关键的糖基转移酶将多糖转移到相应载体。LPS合成中是将多糖在转移酶催化下与脂质A核心相连；而微生物蛋白糖基化是将多糖转移至底物蛋白。因此，Langdon等[42]提出，用生物法可以生产糖蛋白，并进而生产各种糖蛋白结合疫苗。具体方法包括3步：①将表达目的病原菌的聚糖相关基因簇通过克隆连接到适当载体并转入大肠杆菌使其表达；②构建含有糖基化位点的载体蛋白的表达载体；③构建糖基转移酶表达载体，将3种载体转入适当的大肠杆菌并诱导表达，使糖基转移酶可以催化聚糖转移到载体蛋白，从而形成糖蛋白，之后通过纯化得到糖蛋白结合疫苗[19]。

目前，生物法生产糖蛋白结合疫苗的研究大多利用PglB的N糖基化来实现。PglB糖基化系统已在大肠杆菌中表达，但PglB只能催化转移还原末端为HexNAc的多糖，如大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、铜绿假单胞菌、志贺菌、弗朗西斯菌等菌株中的多糖，肺炎链球菌、猪链球菌等中的多糖还原端缺乏相应的位点而无法被转移[19]。通常在多糖结合疫苗研发中，为了引起有效的免疫反应，载体蛋白大多使用的是棒状杆菌和梭菌属的无活性的毒素[43]。尽管有许多毒素可以引起强烈的免疫反应，但无糖基化位点，不能作为载体蛋白。2010年Ihssen等[44]在铜绿假单胞菌的外毒素A之后加了2个可与聚糖结合的序列，在大肠杆菌中使其发生糖基化，以便发酵生产多糖结合疫苗。Fisher等[45]则引入了糖基化位点标签，通过在不同蛋白中连入工程化的糖基化位点标签，使PglB识别并发生糖基化，从而通过工程方法改造合适的底物蛋白，扩大了蛋白的选择范围。

已有2种多糖结合疫苗进入临床试验，其中第一个由生物法合成的多糖结合疫苗是痢疾志贺菌1型结合疫苗，由瑞士联邦生物技术公司所属Glyco⁃Vaxyn AG公司生产，以铜绿假单胞菌的外毒素A作为载体蛋白，目前已完成Ⅰ期临床试验。此外，Gly⁃coVaxyn AG公司还在研制针对金黄色葡萄球菌的荚膜多糖结合疫苗，试验表明生物法糖蛋白疫苗也适用于革兰阳性菌的荚膜多糖[46]。

多糖疫苗作为一种新型疫苗，对传染病的防治具有重大意义，经过几十年的发展，已从最初单纯的多糖疫苗发展到现在的生物法合成多糖结合疫苗。多糖结合疫苗直接针对病原菌特异性多糖，同时诱发机体非T细胞依赖和T细胞依赖的免疫反应，产生长久的免疫保护作用，并有效解决了细菌耐药性导致的病原微生物防治问题。生物法合成糖结合疫苗最为简单、经济、高效，但限于微生物糖基化的研究才刚刚开始，对糖基化机制尚未全面了解，目前只有3套糖基化系统（PglB、PglL、PilO）在大肠杆菌中得到表达。PglB对糖链和底物的特异性要求，使其糖基化不能涵盖所有病原菌多糖；脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL具有更宽松的底物特异性，且对糖链的要求不高，具有很好的应用前景；PilO只能转移短链，许多病原菌糖链较长，且糖链过短会降低抗原性，因此利用PilO生产疫苗范围有限。此外，目前利用生物法合成糖结合疫苗过程中，需要构建病原菌聚糖在工程菌（大肠杆菌）中表达，编码合成聚糖的基因簇较大（往往大于10 kb），操作困难，故存在一定的局限性，因此可将糖基化系统转入无毒的病原菌中来发酵生产多糖结合疫苗，这将是生物法合成多糖结合疫苗的另一种选择。虽然生物法合成结合疫苗的工作刚刚起步，但已展现出广阔的应用前景，有望在病原微生物防治中发挥重要作用。

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