不同地理种源红砂幼苗对PEG胁迫的生理响应

种培芳，苏世平，李毅＊，孙兆成

（1.甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州730070；2.武威市石羊河林业总场小坝口分场，甘肃 武威733300）

红砂（Reaumuriasoongorica）为超旱生小灌木，广泛分布于我国干旱荒漠地区，特别广布于西北的半干旱地区，并且是这些自然分布带的建群种和优势种［1］。其抗逆性强，生态可塑性大，具有很强的抗旱、耐盐和集沙能力，对荒漠地区的生态保护具有重要作用［2，3］。红砂幼苗是影响红砂种群更新的瓶颈之一，而水分是干旱半干旱地区重要的环境因子，水分变化将通过影响红砂幼苗进而影响其种群动态。迄今关于红砂抗旱性的研究已有若干报道［4－9］，不仅有对红砂这一树种的单独研究，亦有与其他抗旱树种［如珍珠（Salsolapasserina）、霸王（Zygophyllumxanthoxylum）等］的比较研究。但对不同红砂种源抗旱性的比较研究至今鲜有报道。

实验室内人工模拟的干旱条件，适于对林木大批量材料进行苗期抗旱鉴定，具有方法简单、重复性好等特点。对林木抗旱性鉴定多采用高渗溶液模拟水分胁迫的方法，目前很多研究者应用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂和筛选剂［10，11］。聚乙二醇（PEG）是一种大分子聚合物，能够夺取水分对植物造成渗透胁迫，在PEG渗透胁迫下，势必引起植物体内一系列的生理生化反应［12］。而同一植物长期生长在异质环境条件下，经过自然选择和适应，会在形态和生理特性等方面产生变异，形成特定的地理种源［13］。不同红砂种源在长期的生长过程中也已形成了自己的生态适应性及生产力等方面的遗传差异。基于这样的理论，本研究利用不同浓度的PEG－6000溶液对4个红砂种源幼苗进行不同浓度、不同时间PEG的渗透胁迫处理，研究红砂幼苗生理指标的变化，旨在了解红砂对PEG胁迫生理响应的种源差异，区分其环境效应和遗传效应，为红砂种源选择、杂交育种，干旱条件下红砂的培育及遗传资源保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验以兰州、武威、张掖和酒泉红砂幼苗为材料，种子均是2008年8月底在各地采集的。各采种地水热条件列于表1中。

表1 红砂各种源地的地理和气候条件Table 1 Original geographical and climatic conditions of the four provenances of R.soongorica

1.2 幼苗的培养

种源育苗试验点在武威市林木种苗繁育中心的温室内。该中心位于103.16°E、38.41°N，年均温7.8℃，7月均温23℃，1月均温－10℃，年均降水量190mm；温室内采用25℃恒温，75%湿度，于2009年3月上旬播种，播种前用0.5%的高锰酸钾溶液消毒20min左右，清水冲洗，再用30℃的温水浸种24h，然后播种于培养穴中，基质成分为沙土10%～20%，沙壤土60%～80%，腐熟羊粪10%～20%。播种后定时定量浇水（由供液系统每天早晨喷雾0.5h），自然光照。待幼苗苗龄3个月，苗高15cm左右时，选取生长一致的幼苗，洗净根系上的泥土，吸干根系上的水分，每个种源红砂取150颗幼苗，平均取30颗放入浓度梯度为0（CK），5%，10%，15%，20%的PEG－6000培养液进行渗透胁迫处理。各浓度分别于处理12，24，48和72h后摘取叶片进行各项生理指标测定。

1.3 相关指标测定方法

脯氨酸（proline，Pro）含量采用茚三酮比色法［14］测定；可溶性糖（soluble sugar，SS）含量采用蒽酮比色法测定［15］；丙二醛（malondiadehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定［14］；超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）活性采用氮蓝四唑法测定［14］；过氧化物酶（peroxide enzyme，POD）活性采用愈创木酚比色法测定［14］；过氧化氢酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法测定，质膜透性（relative permeability of plasma，RPP）采用电导仪测定［16］。

1.4 统计分析

数据显著性分析采用SPSS 13.0完成，多重比较分析采用Duncan法，图片采用Excel 2003完成。

2 结果与分析

2.1 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗渗透调节物质的影响

结果表明（图1）：在不同质量分数和不同时间PEG溶液处理下，红砂叶片脯氨酸（Pro）和可溶性糖（SS）含量均显著高于对照。在胁迫初期（12～24h）Pro和SS含量均有所增加，随着时间的延长（48h），Pro含量增加趋势仍较明显（图1A），但SS含量增加幅度减缓并呈现下降趋势（图1B）。2个指标随处理浓度的增加均呈先高后低的趋势。兰州、武威、张掖和酒泉4个种源红砂幼苗的Pro含量在胁迫72h和15%胁迫处理下达到最大值，分别是CK的4.57，7.95，4.60和5.89倍，相同胁迫下，武威红砂幼苗的Pro含量增幅最大，酒泉第2，张掖次之，兰州最小。兰州、武威、张掖和酒泉4个种源红砂幼苗的SS含量在48h和15%胁迫处理下达最大，分别是CK的5.35，7.05，5.86和7.10倍。相同胁迫下，酒泉红砂幼苗SS含量增加幅度最大，武威第2，张掖次之，兰州最小。均在胁迫72h时和20%浓度达到了最大值，分别是CK的6.33，3.43，3.62和4.81倍。相同胁迫下，武威沙拐枣幼苗的MDA含量增加幅度最小，张掖第2，酒泉次之，兰州增加幅度最大。

2.2 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗丙二醛含量的影响

4个地理种源红砂幼苗叶片丙二醛（MDA）含量在PEG胁迫下均有显著升高（图2），且均在胁迫72h时和20%浓度达到了最大值，分别是CK的6.33，3.43，3.62和4.81倍。相同胁迫下，武威沙拐枣幼苗的 MDA含量增加幅度最小，张掖第2，酒泉次之，兰州增加幅度最大。

图1 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗脯氨酸和可溶性糖含量的影响Fig.1 Effect of osmotic stress with PEG on proline and soluble sugar content of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

2.3 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗活性氧清除酶的影响

4个不同地理种源红砂幼苗叶片的SOD、POD和CAT活性随胁迫时间的延长呈先升高后降低的趋势（图3，4，5），这是其对胁迫时间的适应性表现。除兰州红砂幼苗的SOD和CAT在10%PEG胁迫下活性达到峰值外，其余均在15%PEG处理下活性达到峰值（图3，5）。但各种源达到最大峰值的处理时间却不一样，武威、张掖和酒泉红砂的SOD均是15%处理48h时达最大，分别是CK的4.05，2.98和3.18倍。而兰州红砂则是10%PEG处理48h时达到最大值，是CK的2.78倍。4个地理种源红砂的POD值均是15%PEG处理48h时达最大（图4），分别是CK的12.54，27.76，13.73和15.09倍。4个地理种源红砂的CAT均是15%PEG处理48h时值最大，分别是CK的7.45，18.36，8.34和13.58倍。

图2 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗丙二醛含量的影响Fig.2 Effect of osmotic stress with PEG on MDA content of R.soongoricaseedlings in different geographical provenance

2.4 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗叶片相对质膜透性的影响

随着干旱胁迫时间的延长4个地理种源红砂幼苗的细胞膜透性与对照相比均有所上升（图6），说明在干旱胁迫下，4个地理种源红砂幼苗的细胞膜都受到了一定的伤害，但受害程度种源间存在差异。兰州种源从干旱胁迫开始膜透性就有较大的增幅，重度干旱胁迫（20%和72h）下增幅达到了最高值，是CK的3.5倍。武威种源的膜透性增幅最小，重度干旱胁迫（20%和72h）下仅为CK时的2.1倍。张掖和酒泉种源的膜透性增幅介于两者之间。

2.5 干旱胁迫下红砂种源生理指标的方差分析和相关性分析

4个种源红砂的MDA，Pro，SS，SOD，CAT，POD，RPP等7个指标在10%、15%及20%PEG与5%PEG及对照间差异显著（P＜0.05）（表2）。在处理时间上48和72h与其他2个处理间差异显著（P＜0.05）。在种源间每个指标的差异性不同，比如Pro在武威和酒泉无显著差异，而MDA在这2个种源间差异显著（P＜0.05）。这些结果说明，不同种源红砂幼苗对不同PEG胁迫的生理适应，不随浓度和胁迫时间变化的格局存在差异。

通过分析PEG胁迫下红砂生理指标的相关性发现，4个地理种源红砂的MDA含量与膜透性之间呈一定的正相关，即在干旱胁迫下细胞质膜透性增加的同时，MDA含量也同时增加。4个地理种源的游离Pro和可溶性糖均与细胞膜透性呈极显著正相关（P＜0.01）。4个地理种源红砂的CAT活性与膜透性均呈极显著负相关（P＜0.01），SOD、POD活性与膜透性呈显著（P＜0.05）或极显著负相关（P＜0.01）（表3）。

2.6 4个地理种源红砂幼苗抗旱性的隶属函数值分析

对4个不同地理种源红砂的7个理化指标的抗旱系数进行隶属函数分析，并求其平均值，以评价其抗旱强弱。根据隶属函数平均值的大小对4个不同地理种源红砂的抗旱性进行排序（表4），抗旱性由强到弱的顺序为：武威＞酒泉＞张掖＞兰州。

图3 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗SOD活性的影响Fig.3 Effect of osmotic stress with PEG on SOD activities of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

图4 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗POD活性的影响Fig.4 Effect of osmotic stress with PEG on POD activities of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

图5 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗CAT活性的影响Fig.5 Effect of osmotic stress with PEG on CAT activities of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

图6 PEG胁迫对不同地理种源红砂幼苗质膜透性的影响Fig.6 Effect of osmotic stress with PEG on relative electrical conductivity of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

表2 5个PEG浓度、4个胁迫时间和4个种源红砂生理指标方差分析中的Duncan多重比较检验Table 2 Duncan multiple range test of ANOVA for five PEG concentration，four stress time and four provenances of R.soongorica

表3 PEG渗透胁迫下4个地理种源红砂7个生理指标之间的相关分析Table 3 Correlation analysis of seven physiology index of R.soongoricain four of geographic provenances under PEG

3 讨论与结论

3.1 不同地理种源红砂对渗透胁迫的反应

众多研究表明，SOD对植物抗旱性起着关键作用［17］，但不同研究材料的SOD活性在干旱胁迫下的变化趋势不尽相同［18，19］。本研究结果表明，4个种源红砂幼苗的SOD活性变化趋势基本一致，均为随PEG浓度的升高而呈先升高后降低的趋势，但又随胁迫时间的延长而呈升高趋势，说明干旱胁迫下SOD对不同种源红砂幼苗的保护机制与其胁迫浓度和胁迫时间有关（表2）。研究发现，POD和CAT在清除红砂积累的活性氧方面同样起着重要作用。4个种源中武威种源虽然始终保持较高的POD和CAT活性，但其他每个种源在干旱胁迫期间也都出现了峰值，说明胁迫状态下红砂体内POD和CAT保护酶对体内活性氧的清除能力有一个阈值，在此阈值之内，植株能够提高其体内保护酶活性，加大对活性氧的清除力度，超过此阈值，则保护酶活性下降。许多研究表明MDA含量的增加与电解质外渗率的增大呈正相关［16］，即认为膜质过氧化过程是造成膜结构与功能破坏的重要因素。本研究结果显示，在重度胁迫下（15%和48h以后），4个种源红砂的MDA含量和质膜透性急剧升高，这一结果与前人的结论一致。就种源间比较而言，武威种源红砂在水分干旱胁迫下的MDA含量始终处于较低水平，其质膜受到的伤害最小，即武威种源红砂抵御干旱的能力较其他3个种源强。这可能是由于其体内的SOD、POD及CAT等酶能够保持较高的活性，从而清除干旱胁迫下产生的自由基。通过相关性分析可以发现，对于4个地理种源的红砂来说其游离Pro与膜透性呈极显著正相关，表明游离Pro是红砂的有效调节成分，但调节能力在种源间产生差异，其相关系数分别为0.906，0.985，0.994，0.975；4个地理种源红砂的膜透性虽然与可溶性糖呈正相关，但兰州种源并没有达到显著，所以对于兰州种源红砂可溶性糖也不是其主要调节物质。尽管渗透调节对植物适应干旱胁迫起到了很重要的作用，但是渗透调节有其所发生的条件。一般来说渗透调节发生在中度水平逆境下，并且其调节范围也有一定的限度［20］。分析可以发现，在重度干旱胁迫的情况下，红砂体内的渗透调节物质也呈现一定下降的趋势，抗旱性弱的种源较抗旱性强的种源呈现出较早的下降趋势。这一结果和曹仪植［21］在小麦（Triticumaestivum）上的研究结论一致。

表4 4个地理种源红砂的抗旱能力综合评价Table 4 Comprehensive appraisal of drought resistance of R.soongoricain four geographic provenances

3.2 不同地理种源红砂幼苗抗旱能力的综合评价

植物整体抗旱性的评价不同于一般抗旱性评价，必须综合考虑植物不同生活史阶段、不同层次的抗旱性指标的贡献大小，同时根据各项指标反映的抗旱性信息大小来进行评价［22］。本研究在不同浓度和时间的PEG干旱胁迫处理后对不同红砂种源的抗旱性指标进行综合分析，无论从浓度、时间还是种源水平上任何一个指标来评价红砂的抗旱性所得的结果均不尽相同（表2），而且各指标之间关系复杂，不同指标的重要性也不相同，所以需对其进行综合分析。隶属函数分析提供了一条在多指标测定基础上对红砂苗木抗旱性进行综合评价的途径，避免了单一指标的片面性［23］。红砂是旱生植物，所以，总体上它是一个很抗旱的种，但因种内遗传漂移、突变、迁移等因素的影响最终会形成形态、生理各异的不同种源和地理小种，而种源内部应该存在着抗旱性差异。根据红砂生长生境的水分条件可以推断酒泉种源因长期适应降水少、蒸发强烈和土壤干旱的环境而对渗透胁迫的适应性要比武威、张掖及兰州种源的强。但结果表明，4个种源红砂的抗旱能力依次为：武威＞酒泉＞张掖＞兰州。这一结果与曾研究的自然条件下这4个地理种群红砂抗旱性的结论是一致的［24］。究其原因可能是样地选择在鸳鸯池水库旁边，空气湿度高于其他样地，又或者是样地的地下水位较高等原因。对种源的抗旱性研究结果证实了这2种推测是合理的。这一结论同时也说明，影响植物抗旱性的水分因素很多，单纯根据部分水分状况来推测植物的抗旱性会存在一定的误差。因此，建议在研究植物抗旱性时一定要充分考虑各种水分条件。

［1］ 刘家琼，邱明新，蒲锦春，等.我国典型超旱生植物——红砂［J］.植物学报，1982，24（5）：485－488.

［2］ 马茂华，孔令韶.新疆呼图壁绿洲外缘的琵琶柴生物生态学特性研究［J］.植物生态学报，1998，22（3）：237－244.

［3］ 黄培祐，聂湘萍.准噶尔盆地中部琵琶柴群落的生境研究［J］.新疆大学学报，1988，5（3）：66－71.

［4］ 曾彦军，王彦荣，保平，等.几种生态因子对红砂和霸王种子萌发与幼苗生长的影响［J］.草业学报，2005，14（5）：24－31.

［5］ 王孝安.安西荒漠植物群落和优势种的分布与环境的关系［J］.植物学报，1998，40（11）：1047－1052.

［6］ 马剑英，周邦才，夏敦胜，等.荒漠植物红砂叶绿素和脯氨酸累积与环境因子的相关分析［J］.西北植物学报，2007，27（4）：769－775.

［7］ 贾荣亮，周海燕，谭会娟，等.超旱生植物红砂与珍珠光合生理生态日变化特征初探［J］.中国沙漠，2006，26（4）：631－636.

［8］ 冯亮亮，唐红，李毅，等.甘肃红砂不同种群遗传多样性的ISSR分析［J］.草业学报，2011，20（1）：125－130.

［9］ 刘玉冰，张腾国，李新荣，等.红砂忍耐极度干旱的保护机制：叶片脱落和茎中蔗糖累积［J］.中国科学C辑生命科学，2006，36（4）：328－333.

［10］ 王瑾，刘桂茹，杨学举.PEG胁迫下小麦再生植株根系特性与抗旱性的关系［J］.麦类作物学报，2006，26（3）：117－119.

［11］ 许桂芳.PEG胁迫对2种过路黄抗性生理生化指标的影响［J］.草业学报，2008，17（1）：66－70.

［12］ 高暝，李毅，种培芳，等.渗透胁迫下不同地理种源白刺的生理响应［J］.草业学报，2011，20（3）：99－107.

［13］ 王丽华，姜春玲，冯玉龙.不同地理种源长白落叶松生理生态特性的研究［J］.植物研究，1999，19（2）：165－171.

［14］ 郝再彬，苍晶，徐仲.植物生理实验［M］.哈尔滨：哈尔滨大学出版社，2004：101－108.

［15］ 王学奎，章文华，郝再彬.植物生理生化原理与技术［M］.北京：高等教育出版社，2006：20.

［16］ 朱建军，王洪春.生物膜渗透特性的理论分析［J］.植物生理学通讯，1986，（1）：6－10.

［17］ 李霞，阎秀峰，于涛.水分胁迫对黄檗幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响［J］.应用生态学报，2005，16（12）：2353－2356.

［18］ 聂磊，刘鸿先，彭少麟.水分胁迫对长期UV－B辐射下柚树苗生理特性的影响［J］.植物资源与环境学报，2001，10（3）：19－24.

［19］ 韩蕊莲，李丽霞，梁宗锁，等.干旱胁迫下沙棘膜脂过氧化保护体系研究［J］.西北林学院学报，2002，17（4）：1－5.

［20］ Erra J R，Sinelair T R.Osmolyte accumulation：can it really help increase crop yield under drought conditions［J］.Plant Cell and Environment，2002，25：333－341.

［21］ 曹仪植.水分胁迫下小麦体内游离脯氨酸积累及其ABA在其中的作用［J］.植物生理学报，1985，11（1）：9－16.

［22］ 谢贤健，兰代萍，白景文.三种野生岩生草本植物的抗旱性综合评价［J］.草业学报，2009，18（4）：75－80.

［23］ 韩瑞宏，卢欣石，高桂娟，等.紫花苜蓿抗旱性主成分及隶属函数分析［J］.草地学报，2006，14（2）：142－146.

［24］ 种培芳，苏世平，李毅.4个地理种群红砂的抗旱性综合评价［J］.草业学报，2011，20（5）：26－33.