遗传性对称性色素异常症一个家系DSRAD基因突变分析

易恒安，李敏，邱玉芬

(深圳市龙岗区横岗人民医院皮肤科，广东深圳518115)

遗传性对称性色素异常症一个家系DSRAD基因突变分析

易恒安，李敏，邱玉芬

(深圳市龙岗区横岗人民医院皮肤科，广东深圳518115)

目的对遗传性对称性色素异常症一个家系DSRAD基因突变进行检测，以期寻找到新的致病突变。方法收集一患有遗传性对称性色素异常症家系，该家系除了有典型的皮疹外，身体发育、智力均正常，五官科及内科检查正常，无明显的系统症状，采用RT-PCR方法从人外周血中获得DSRAD基因cDNA，并筛选出合适的基因序列与人类基因库中的相应基因进行对比分析，找出可疑的位点，并通过单链构象技术对新突变进行验证。结果该家族DSRAD基因序列的测定结果证实患者染色体中存在碱基替换的情况，患者碱基由Q389Q替换为A1167G，患者编码氨基酸并没有发生改变，仍然为谷氨基酸，属于同义突变。患者DNA经单链构象分析证实为同一家族的基因，在家族健康人及非血缘关系的人群中未发现编码基因。结论患者皮肤色素出现异常的改变可能与患者基因出现同义突变有关，但目前该突变机制的研究还有待进一步深入分析。

遗传性；对称性；色素；DSRAD基因；突变

遗传性对称性色素异常症(DSH)属于人类常染色体中显性基因异常的疾病，其外显率较高，目前改病的发生机理尚不明确。近年来国内外已有相关的遗传学家对其致病机理从遗传学的角度进行研究，并确定了该疾病的出现是由于患者体内双链RNA上的DSRAD出现突变引起的[1]。目前相关研究已经证实在DSH患者中存在着40多处这种突变。为了更深入了解患者DSRAD突变过程，本文对DSH家族中存在的DSRAD基因突变进行检测确认，并对DSRAD突变对皮肤代谢产生的作用进行分析，现分析结果如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料于2012年1～6月选取DSH疾病家系中3代的人群为研究对象，共12人，其中患者6例，先证者是15岁的女性，患者智力、体格发育与同龄人无疑，不存在系统性疾病。患者4岁开始表现在手背部出现色素减退的现象，随着患者年龄的增长，其色素退斑现象变得显著，同时伴有皮损蔓延及色素沉着斑点的现象。目前患者病情已经发展至右脚踝及侵入到手背部，皮损现象在夏季尤为明显，冬季病情减轻。随着年龄的增加，其色素沉着现象显著，皮损出现蔓延。先证者的母亲从2岁开始初见皮损，随着年龄增加，皮损显著明显，色素沉着情况严重，面部出现雀斑。患者舅舅也出现类似的症状，患者四肢出现深浅不一的色素减退斑，其临床症状符合DSH，但患者皮肤、毛发及牙齿均表现正常。

1.2 方法(1)DNA提取：采用改良盐析法提取基因组DNA；该方法操作步骤简单，DNA损失少，获取率高，而且该法所用的试剂价格便宜，性质稳定，不需特殊实验条件及蛋白酶K，所得DNA纯度高。(2)基因组mRNA的提取：采集先症者与一名正常家系成员静脉血5 ml以提取mRNA。(3)RT-PCR获取cDNA。(4)设计DSRAD基因的引物：根据引物设计原则和GenBank中公布的人DSRAD基因的cDNA序列，通过Primer5.0软件进行引物设计。由于DSRAD基因的CDS区有3 680多个碱基，所以拟设计3对PCR特异性引物扩增该基因全长。(5)聚合酶链式反应(PCR)：由“变性——退火——延伸”三个基本反应步骤构成。(6)切胶回收特异性目的条带：在紫外光下用干净锋利的刀片切下琼脂糖凝胶中的目的片段并进行回收。(7)连接：回收的目的片段DNA与pTA2载体进行链接。(8)制备感受态细菌DH5α。(9)转化：将连接产物加入感受态细菌，转化后涂布于含有Amp，X-gal和IPTG的LB平板上于37℃培养箱过夜。(10)阳性克隆鉴定：随机挑取约5个白色菌落以DSRAD引物进行菌落PCR，鉴定出目的基因的阳性克隆。(11)DSRAD的序列测定与分析：将经过鉴定的阳性克隆生物技术有限公司进行测序，将测序结果通过BLAST程序网上比对找出可能的突变位点。(12)单链构象多态性分析。(13)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。(14)银染。

2 结果

采用PCR扩增法克隆DARAD后与BLAST比对，发现在DSRAD中第1167位点的碱基中存在着可疑的突变，碱基上的起始密码ATG中的A突变为G，从而引起399位的CAA密码子转化为CAG，但编码的氨基酸种类并没有发生改变，仍然为谷氨酰胺。通过SSCP分析获知患者染色体存在异常，而在正常的家族成员及非血缘关系的人群中不存在此情况。

3 讨论

DSH是属于常染色体的显性突变，因此在患病者家族中表现的是显性病症[2]。高敏等在2003年时对该病进行了相应的研究，将致病基因定位在1号常染色体11.6厘摩尔的区域内，Miyamura等认为该病的突变位点是在该区间的DSRAD区域内，该基因属于ADAR族的成员[3]。ADAR基因广泛存在于自然界各种生物中，其生物学功能是能够诱导蛋白质翻译及对RNA进行转录。该基因段全长为30 kb，由15个外显子组成，最长的转录基因为6.7 kb，其编码基因中含有1 226个腺苷脱氨酶(编码含有1 226个氨基酸序列的双链RNA特异性腺苷脱氨酶)该酶能用于信使RNA中的中的序列与DNA上的酶不对应，从而产生特定的生物学性能[4]。相关研究显示该酶中存在2个Z区及1个alpha区，从而引导蛋白质向发生转录的DNA靠近，同时对RNA产生作用[5]。双链RNA结合区是由2～7号的外显子进行编码的，能识别底物，同时与底物进行结合[6]。如果该酶位点出现缺失会导致其不能形成二聚体，从而影响该基因的功能，导致疾病的发生。

引起该病突变的主要原因是基因的错义突变，其次是碱基插入或缺失引起的基因代码出现无义性突变[7]。本研究采用PCR扩增法对DSRAD基因进行序列测定或全克隆，同时在采用SCCP技术进行突变的鉴定，从而发现患者第1 167位点中的碱基由A替换为G，在正常家族人群或非血缘关系的人群中未出现此种突变。该突变一般情况下不会引起氨基酸序列的改变，但核苷酸改变会导致患者转录效率受到影响，同时氨基酸及密码子的翻译效率并不相同，可引起蛋白质表达发生变化，最终引起疾病发生[8]。

对DSRAD基因变异进行分析，能有效了解对称性色素遗传异常疾病的发生的机理，从而为临床对该病的诊断及治疗提供临床理论依据。

[1]张国龙,施和建,邵敏华,等.遗传性对称性色素异常症两家系基因突变检测研究[J].临床皮肤科杂志,2011,40(3):958-957.

[2]林志淼,徐辉,李岩,等.遗传性对称性色素异常症两家系ADAR基因的突变[J].中国皮肤性病学杂志,2008,22(8): 470-471.

[3]佃艳,孟岩,王铮,等.遗传性对称性色素异常症一家系中ADAR基因的新突变[J].医学研究杂志,2009,38(1):17-19.

[4]李明,杨莉佳,华海康,等.遗传性对称性色素异常症1例家系调查及其病因研究[J].临床皮肤科杂志,2007,36(1):3-5.

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[7]王晓鹏,刘艳,肖生祥,等.两个遗传性对称性色素异常症家系的DSRAD基因剪切突变[J].中国皮肤性病学杂志,2010,24(5): 502-504.

[8]李艳雯,汪峰,黎宇.遗传性对称性色素异常症家系中ADAR1基因的遗传分析[J].重庆医学,2012,41(2):117-118.

Mutation analysis of DSRAD gene in a Chinese family with dyschromatosis symmetrica hereditaria.

YI Heng-an,LI Min,QIU Yu-fen.Department of Dermatology,Henggang People's Hospital of Longgang District of Shenzhen City,Shenzhen 518115,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo detect the mutation of DSRAD gene in a Chinese family with dyschromatosis symmetrica hereditaria(DSH),and to explore new pathogenic mutation.MethodsMembers of a Chinese family with DSH,who had typical rash,were enrolled in this study,with normal physical development and intelligence,no obvious systematic symptoms.RT-PCR was applied to obtain DSRAD gene cDNA from human peripheral blood.Proper gene sequences were selected and compared with corresponding gene of human gene pool to identify suspicious sites, and new mutations were validated by single strand conformation.ResultsDSRAD gene sequence analysis confirmed the presence of nucleotide substitutions in the patient's chromosomes,with Q389Q replaced by A1167G.The encoding amino acid was still glutamic acid,which indicated a synonymous mutation.Single strand conformation confirmed that the DNA of the patients was of the same family,and that the healthy members and non-kinship members were not detected with the coding gene.ConclusionThe abnormal changes of skin pigment may be due to synonymous mutations in gene.The mutation mechanism still needs further study.

Hereditary;Symmetry;Pigment;DSRAD gene;Mutation

R394

A

1003—6350（2013）09—1266—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0535

2012-12-14)

易恒安。E-mail：164460075@qq.com