骨质疏松与骨髓间充质干细胞分化调控的研究进展

龚颜，王键综述，魏劲松审校

（广东医学院附属医院骨科，广东湛江524000）

·综述·

骨质疏松与骨髓间充质干细胞分化调控的研究进展

龚颜，王键综述，魏劲松审校

（广东医学院附属医院骨科，广东湛江524000）

骨质疏松是临床上常见的老年性疾病，其发病机制尚未完全明确。骨髓间充质干细胞在骨髓中可分化为成骨细胞和成脂细胞，其分化平衡紊乱目前被认为是骨质疏松发病机制之一。了解转录水平基因调控骨髓间充质干细胞的分化方向的机理，为骨质疏松的药物和干细胞治疗提供新思路。

骨质疏松；骨髓间充质干细胞；转录因子

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨脆性增加而易发生骨折的一种全身性骨骼疾病。临床磁共振波谱分析发现骨质疏松患者与骨髓脂肪组织增多有关[1]。骨髓腔中成骨细胞和脂肪细胞都起源于同一多潜能分化的干细胞—骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSCs)。骨髓脂肪有害增多导致骨丢失的原因被认为是成骨和成脂细胞的祖细胞MSCs分化平衡紊乱[2]。多种分子及信号通路在MSCs定向分化过程中起调节作用。转录水平上MSCs成骨细胞或是成脂细胞定向分化的基因调控机制是国内外研究的热门领域。

1 成骨分化的转录水平基因调控

1.1 成骨分化与转录因子RUNX2 RUNX2 (Runt-related transcription factor-2)也被称作CBFα1 (Core-binding factorα1)，是转录因子(RUNT)家族成员之一，其含有一个RUNT结构域(DNA结合区)、一个富含脯氨酸－丝氨酸－苏氨酸C末端(转录激活区)，它还含有两个区别于其他RUNT相关蛋白的氨基末端。RUNX2及其下游基因是干细胞向成骨细胞分化及成熟过程中所必需的[3]，它通过特异性结合含有核心序列(PuCCPuCA)的增强子结合区从而直接激活成骨细胞相关转录因子基因表达，如骨钙素、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和Ⅲ型胶原酶基因[4]。如果找到一条能选择性地促使MSCs向成骨细胞系分化的途径，那么在骨重建中就能更好地利用MSCs的多向分化能力。RUNX2基因转染小鼠MSCs后，RUNX2蛋白在转录后1 d开始增多，成骨标志物(ALP、钙结节)mRAN表达与RUNX2平行增多。转染RUNX2的MSCs可以明显提高治疗颅盖骨缺损的效果，还能增加骨量及骨矿物质密度。该研究表明转染RNUX2基因可能是增强MSCs成骨分化的潜力和成骨相关基因表达的一种有效途径[5]。各种信号通路参与MSCs分化方向的调节，RUNX2基因表达可以被多种信号传导途径激活，如BMP、Wnt、Notch、Hedgehog和FGFs，RUNX2就是各种信号通路集合的焦点[6]。

1.2 成骨分化与转录因子Osterix Osterix因与先前发现的Sp基因家族成员Sp1～Sp6同源，故又被称作Sp7(Special protein)，其蛋白结构特点是其羧基末端有三个锌指结构的DNA结合域。Osterix是MSCs成骨细胞分化过程中又一个或不可缺的转录因子，是膜内成骨和软骨成骨过程的重要调节因子。Osterix基因敲除小鼠模型中，胚胎发育过程中长骨骨髓腔和骨小梁形成明显延迟，骨骼生长也伴随减少[7]。来源于小鼠颅盖骨的MSCs因高表达Osterix而有更强的成骨分化能力，但是成脂分化减弱[8]。Kurata等[9]在培养Osterix基因修饰的干细胞过程中发现Osterix超表达刺激骨桥蛋白和ALP的表达，但是成骨分化晚期标志物骨钙素基因的表达未上调。说明Osterix虽在干细胞成骨分化中起促进作用，但不能刺激干细胞分化为成熟的成骨细胞。在体外培养的hMSCs用麦考酚酸处理后，RUNX2和Osterix表达都下调，MSCs成骨相关基因骨桥蛋白和BMP-2表达受到抑制[10]。因此MSCs分化为成熟的成骨细胞是一个复杂的过程，需要Runx2和Osterix等多因子的参与。

2 成脂分化的转录水平基因调控

2.1 成脂分化与转录因子PPARγPPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ)是细胞核受体PPAR家族成员中的一种转录因子，含有DNA结合区、配体结合区和辅因子复合物等结构域，存在PPARγ1和PPARγ2两种主要亚型，在成脂分化过程中起重要作用[11-12]。噻唑烷二酮类药物是PPARγ激活剂，临床上服用噻唑烷二酮类(TZDs)药物的糖尿病患者骨量减少，发生骨折的风险度增加[13]。噻唑烷二酮类药物罗格列酮可导致大鼠骨量丢失，成骨细胞数量减少，骨形成速率降低，还能使MSCs成骨分化受到抑制[14]。体外实验用PPARγ拮抗剂GW9662处理并成骨诱导hMSCs，其成骨早期标志物、ALP、OPG表达增强；将处理后MSCs移植到小鼠颅盖骨缺损部位可以增强干细胞修复骨缺损的能力[15]。近年研究发现不管罗格列酮PPARγ激活剂还是PPARγ超表达都可以促进成骨分化。相反，PPARγ基因敲除减弱了成骨分化。但是，罗格列酮随后会增强成骨系细胞的活性氧族蓄积和调亡。与此不同的是，罗格列酮抑制了成脂系细胞的活性氧族蓄积和调亡。因此，当PPARγ的激活时，成骨系细胞对氧化应激和凋亡更敏感。这与临床上服用TZDs的患者骨髓脂肪生成更多、骨形成减少和骨折风险增加并不矛盾[16]。也有研究表明，在BMPs诱导下，PPARγ2超表达不仅促进了MSCs成脂分化，也能增强成骨分化。然而PPARγ2敲除后MSCs表现为成脂和成骨能力都下降[17]。因此，PPARγ可能在MSCs成骨和成脂分化中都起重要作用。PPARγ影响干细胞分化方向时可被多种分子信号调节，如BMP[17]、hedgehog信号[18]和经典Wnt信号通路[19]等，都可以调节干细胞中PPARγ的作用。

2.2 成脂分化与转录因子C/EBP(CCAAT/enhancer-binding protein alpha)C/EBP属于含有bZIP蛋白的一类转录因子，其bZIP结构域由富含碱性氨基酸链连接一个亮氨酸拉链的二聚体组成。C/EBP亚型主要有α、β和δ蛋白三种，由C/EBP相关基因编码，具有相似的DNA结合专一性和亲和力,并表达于脂肪、肝和肠组织[20]。C/EBPβ和δ在成脂分化早期表达，而C/EBPα在成脂分化晚期才大量表达，它们在脂肪细胞最终分化过程中起级联调节作用[21]。超表达外源性C/EBPsα和β，不管是体外培养，还是体内移植都能增强hMSCs成脂分化[22]。近年研究发现，STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3)能结合C/EBPβ启动子远侧区，调节C/EBPβ基因表达，从而促进早期的成脂分化[23]。吲哚美辛促进MSCs成脂分化是因为同时增强了C/EBPβ和PPARγ2基因表达[24]。C/EBPβ和δ基因在成脂分化早期快速地被诱导表达，最后刺激PPARγ和C/EBPα基因表达[25]。因此，在MSCs成脂方向分化过程中，可能需要多种转录因子参与，多转录因子间存在级联反应关系。

3 结语

MSCs具有多向分化功能，在骨髓中调节MSCs定向分化的转录因子之间相互影响机制目前仍未完全明确。诱导成脂分化的过程中hMSCs同时表达PPARγ1和PPARγ2，而诱导其成骨分化过程中只检测到PPARγ1表达。PPARγ拮抗剂和PPARγ基因敲除可以抑制hMSCs成脂分化但是不影响成骨分化转录因子Runx2的表达，也不能促进其成骨分化[26]。说明单一因素不能影响MSCs分化方向，需要多转录因子参与调控。PPARγ和Runx2之间可能存在相互抑制的关系。3T3-L1成脂细胞与成骨细胞共培养体系中，成脂细胞PPARγmRNA表达增高的同时，成骨细胞的Runx2表达下降。当用siRAN敲除PPARγ基因时，这种现象受到遏制[27]。体外模拟细胞外基质的实验中，成骨分化早期MSCs因高表达RUNX2，MSCs的成骨分化能力增强，但是抑制了PPARγ基因的表达[28]。RUNX2基因转染MSCs后，成骨细胞标志基因碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白等表达上调，然而PPARγ2表达下降，抑制了MSCs成脂分化[29]。如果能找到一条有效途径来调节骨髓中MSCs分化为成骨细胞，而不是有害的脂肪细胞，临床上在治疗骨质疏松、老年患者骨折和一些溶骨性疾病时，干细胞作为药物的靶细胞和移植细胞时将有很好的运用前景。

[1]Yeung DK,Griffith JF,Antonio GE,et al.Osteoporosis is associated with increased marrow fat content and decreased marrow fat unsaturation:a proton MR spectroscopy study[J].J Magn Reson Imaging, 2005,22(2):279-285.

[2]Nuttall ME,Gimble JM.Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications[J].Curr Opin Pharmacol,2004,4:290-294.

[3]Ducy P,Starbuck M,Priemel M,et al.A Cbfa1-dependent genetic pathway controls bone formation beyond embryonic development [J].Genes Dev,1999,13:1025-1036.

[4]Kern B,Shen J,Starbuck M,et al.Cbfa1 contributes to the osteoblast-specific expression of type I collagen genes[J].J Biol Chem, 2001,276:7101-7107.

[5]Zhao Z,Wang Z,Ge C,et al.Healing cranial defects with AdRunx2-transduced marrow stromal cells[J].J Dent Res,2007,86 (12):1207-1211.

[6]Lin GL,Hankenson KD.Integration of BMP,Wnt,and notch signaling pathways in osteoblast differentiation[J].J Cell Biochem,2011, 112(12):3491-3501.

[7]Oh JH,Park SY,de Crombrugghe B,et al.Chondrocyte-specific ab-lation of Osterix leads to impaired endochondral ossification[J]. Biochem Biophys Res Commun,2012,418(4):634-640.

[8]Li D,Liang C,Xu L,et al.Murine calvaria-derived progenitor cells express high levels of osterix and lose their adipogenic capacity[J]. Biochem Biophys Res Commun,2012,422(2):311-315.

[9]Kurata H,Guillot PV,Chan J,et al.Osterix induces osteogenic gene expression but not differentiation in primary human fetal mesenchymal stem cells[J].Tissue Eng,2007,13(7):1513-1523.

[10]Cao WJ,Liu LZ,Lai XY,et al.Effects of mycophenolic acid on human bone marrow-derived mesenchymal stem cellsin vitro[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2011,40(5):467-474.

[11]Nolte RT,Wisely GB,Westin S,et al.Ligand binding and co-activator assembly of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma[J].Nature,1998,395(6698):137-143.

[12]Kawai M,Rosen CJ.PPARγ:a circadian transcription factor in adipogenesis and Osteogenesis[J].Nat Rev Endocrinol,2010,6(11): 629-636.

[13]Grey A,Bolland M,Gamble G,et al.The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist rosiglitazone decreases bone formation and bone mineral density in healthy postmenopausal women:a randomized,controlled trial[J].J Clin Endocrinol Metab, 2007,92(4):1305-1310.

[14]Ali AA,Weinstein RS,Stewart SA,et al.Rosiglitazone causes bone loss in mice by suppressing osteoblast differentiation and bone formation[J].Endocrinology.2005,146(3):1226-1235.

[15]Krause U,Harris S,Green A,et al.Pharmaceutical modulation of canonical Wnt signaling in multipotent stromal cells for improved osteoinductive therapy[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(9): 4147-4152.

[16]Bruedigam C,Eijken M,Koedam MA,et al.A new concept underlying stem cell lineage skewing that explains the detrimental effects of thiazolidinediones on bone[J].Stem Cells,2010,28(5):916-927.

[17]Kang Q,Song WX,Luo Q,et al.A comprehensive analysis of the dual roles of BMPs in regulating adipogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal progenitor cells[J].Stem Cells Dev, 2009,18(4):545-559.

[18]Kim WK,Meliton V,Amantea CM,et al.20(S)-hydroxycholesterol inhibits PPARgamma expression and adipogenic differentiation of bone marrow stromal cells through a hedgehog-dependent mechanism[J].J Bone Miner Res,2007,22(11):1711-1719.

[19]Takada I,Mihara M,Suzawa M,et al.methyltransferase activated by non-canonical Wnt signalling suppresses PPAR-γ transactivation [J].Nat Cell Biol,2007,9(11):1273-1285.

[20]Cao Z,Umek RM,McKnight SL.Regulated expression of three C/ EBP isoforms during adipose conversion of 3T3-L1 cells[J].Genes Dev,1991,5(9):1538-1552.

[21]Yeh WC,Cao Z,Classon M,et al.Cascade regulation of terminal adipocyte differentiation by three members of the C/EBP family of leucine zipper proteins[J].Genes Dev,1995,9(2):168-181.

[22]Yang HN,Park JS,Woo DG,et al.C/EBP-α and C/EBP-β-mediated adipogenesis of human mesenchymal stem cells(hMSCs)using PLGA nanoparticles complexed with poly(ethyleneimmine)[J].Biomaterials,2011,32(25):5924-5933.

[23]Zhang K,Guo W,Yang Y,et al.JAK2/STAT3 pathway is involved in the early stage of adipogenesis through regulating C/EBPβtranscription[J].J Cell Biochem,2011,112(2):488-497.

[24]Styner M,Sen B,Xie Z,et al.Indomethacin promotes adipogenesis of mesenchymal stem cells through a cyclooxygenase independent mechanism[J].J Cell Biochem,2010,111(4):1042-1050.

[25]Hishida T,Nishizuka M,Osada S,et al.The role of C/EBPdelta in the early stages of adipogenesis[J].Biochimie,2009,91(5): 654-657.

[26]Yu WH,Li FG,Chen XY,et al.PPARγ suppression inhibits adipogenesis but does not promote osteogenesis of human mesenchymal stem cells[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(2):377-384.

[27]Liu LF,Shen WJ,Zhang ZH,et al.Adipocytes decrease Runx2 expression in osteoblastic cells:Roles of PPARγ and adiponectin[J]. Journal of Cellular Physiology,2010,225(3):837-845.

[28]Hoshiba T,Kawazoe N,Chen G.The balance of osteogenic and adipogenic differentiation in human mesenchymal stem cells by matrices that mimic stepwise tissue development[J].Biomaterials,2012, 33(7):2025-2031.

[29]董世武,应大君,段小军,等.核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞成骨细胞标志基因表达的影响[J].中国修复重建外科杂志, 2005,19(9):746-750.

R681.1

A

1003—6350（2013）03—0427—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.03.0188

2012-08-30)

广东省科技计划项目（编号：2010B031600288）

魏劲松。E-mail：jlccwjs@163.com