神经退行性疾病线虫模型的相关综述

朱淼，李莎，刘志培，白焕丽，孟轲音，李忠义，王雄，万家余，陈志宝

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.军事医学科学院军事兽医研究所；3.吉林大学；4.天津大学）

近年来，神经退行性疾病越来越多的受到了人们的关注，然而，高等动物神经系统复杂多样，为研究该疾病带来了很大的困难。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种经典的模式生物，它的出现使得生命科学等领域许多复杂问题变得简单化，对生命科学的发展起着举足轻重的作用。秀丽线虫成虫长约1 mm，身体为半透明，以大肠杆菌OP50为食，繁殖速度快，实验周期短，易在实验室培养，对人、动物和植物都没有危害。新秀丽线虫已经被证明能够系统的研究神经功能、行为、年龄以及神经退化疾病[1-5]。

1 朊病毒病线虫模型

1.1 鼠PrP 表达导致转基因线虫运动、生长的损伤

朊病毒病是一类致死性的神经系统退行性疾病，在哺乳动物中常见疯牛病、羊瘙痒症、鹿慢性消耗病、猫海绵状脑病以及传染性水貂脑软化病等；在人身上则发现了库鲁病、致死性家族失眠症、克雅氏病以及格斯特曼综合症等[6]。迄今为止，其发病机制依然是一个未解之谜。国内外研究人员从不同切入点着手研究，发现大量与朊蛋白构象转变、朊病毒致病的相关重要信息。

朊蛋白有两种，一种是正常形式的PrPC，一种是致病形式的PrPSC，两种蛋白的构型不同，其理化性质也不同，PrPC构象改变为PrPSC后能引发人和动物朊病毒病。Kyung-Won Park[7]等用没有致病性的线虫作为研究朊病毒病模型，他们提取了细胞形式的鼠朊蛋白（MoPrP），并与CFP 或YFP 融合后（CFP 或YFP是一种指示荧光，证明目的基因成功转入线虫体内），在线虫的肌细胞壁上表达。通过实验发现朊蛋白（PrP）在神经元细胞的堆积，将会导致PrPSC类似的分子结构以及细胞显著凋亡[8-9]。此外，提高PrP 水平将会在其肌细胞中检测到肌肉相关疾病，如人体肌炎，多肌炎，皮肌炎，神经源性肌肉萎缩[10]。然而，也有相反的报道，细胞形式的PrP 表达对N2a 细胞或初期的神经元培养没有毒性[11-12]。

Kyung-Won Park 等人利用转基因线虫表达细胞形式MoPrP，并且出现了一种外形惊人的短粗类型的线虫。尽管该类型的线虫潜在机制还不清楚，但是其异常的肌肉结构及严重的运动损伤提示我们细胞形式的MoPrP 堆积，可能对线虫产生毒性。事实上，在线虫的肌细胞壁上表达MoPrP（23-231），它能够模仿启动子unc-54 突变，导致肌细胞形态和功能改变，而且这种获得性的功能显性可能有助于我们对朊病毒介导毒性的研究。由于MoPrP（23-231）被检测到对蛋白水解酶K 没有抵抗作用，所以，在线虫肌细胞中产生的MoPrP（23-231）与PrPSC的结构不同[13]。

1.2 在线虫体内PrP 的突变影响蛋白的发病机制及细胞毒性

MoPrP（Q167R）是密码子的167 位点由谷氨酰胺突变为精氨酸突变的鼠PrP，MoPrP（Q167R）能够抑制绵羊痒病。人们构建了共表达MoPrP（Q167R）（23-231）-YFP 的线虫和表达MoPrP（23-231）-CFP的线虫。通过实验发现Q167R 能够减少在线虫体内PrP 的毒性，其作用机制还不清楚。通过实验发现MoPrP（Q167R）（23-231）-YFP 和MoPrP（23-231）-CFP 有共同的表达位点，这种没有毒性的低聚体可能是由于PrP（Q167R）影响野生型PrP 的折叠导致的。

总之，线虫和哺乳动物的朊蛋白的折叠是相似的，因此，我们可以用线虫研究潜在的细胞机制。到目前为止，朊蛋白杀死神经元的机制仍是一个谜。

1.3 突变的Fyn 激酶对朊蛋白秀丽线虫模型的影响

尽管朊蛋白的传播途径已经被很好的了解，但是朊蛋白神经毒性的信号肽激活途径仍然不被了解，Nicolas Bizat 等鉴别了一种Fyn 相关激酶src-2，其是从插入一段突变的人PrP 中获得的，该基因在线虫体内产生毒性。转基因PrP 在质膜上表达，部分对蛋白水解酶K（PK）有抵抗作用，突变体PrP 检测到不溶性的蛋白。src-2 功能的缺失会降低突变体PrP 的神经毒性，而不会减少PrP 的蛋白水解酶水平。寿命调节因子sir-2.1/SIRT1，是一种sirtuin 的去乙酰化酶，作为蛋白神经毒性改变剂，增加sir-2.1 的剂量会减少PrP 的神经毒性，而sir-2.1 功能缺失会加重神经毒性。而且这些影响没有改变对蛋白水解酶K 的抵抗作用。这些结果显示了Fyn 能够调节突变体PrP 的神经毒性，sirtuin 的激活能够减缓神经毒性的影响。实验发现，Sirtuin 能够治疗潜在的蛋白神经毒性，并影响细胞内的信号和内稳态。

2 帕金森氏病线虫模型

帕金森综合症是一种黑质纹状体系统多巴胺神经功能受损所致多巴胺与乙酰胆碱平衡失调的一种慢性疾病，帕金森病是属于α-共核蛋白错误折叠性神经退行性疾病，其病理改变主要为苍白球或壳核部位中的细胞出现病变。以运动迟缓、静止性震颤和强直为主要特征。在LRRK2 的突变常常发生在常染色体显性遗传和原发性帕金森疾病（PD），这些突变普遍发生在GTP 酶（R1441C/G）和激酶（G2019S）区域。体外研究已经发现，R1441C 和G2019S 突变与激酶活性增加相关。这些LRRK2 基因蛋白的过度表达导致年龄依赖性的多巴胺神经元退行性变，行为异常，运动功能障碍，并伴随着体内多巴胺水平的减少。相比之下，R1441C 和G2019S 突变导致比野生型蛋白更严重的表型。

Chen Yao 和Rabih El Khoury[14]等构建了多巴胺神经元表达人野生型LRRK2 基因和两个多巴胺相关的突变基因R1441C 和G2019S。这些转基因线虫有多巴胺方面的病理学特征，包括成人进行性神经退化，运动功能障碍并伴随着多巴胺神经递质的缺失。这些不正常的现象可以被外源多巴胺治疗。因此，LRRK2 转基因线虫对于体外研究LRRK2 与多巴胺是非常有用的，而且预示着对多巴胺发病机制的破解。

从该线虫模型中可以得到一些启示：第一，野生型LRRK2、R1441C 和G2019S 过度表达，将会诱导神经退化，并伴随着运动障碍和多巴胺的耗竭。LRRK2 和多巴胺相关突变基因R1441C 和G2019S的病理学显性显示出更严重的损伤。这些结论证明：多巴胺相关突变基因R1441C 和G2019S 能够获得一个有害的功能，诱导神经退化和功能缺失。第二，在线虫体内，不激活LRRK2 活性，而K1347A 突变，表现出抑制LRRK2 诱导的多巴胺神经退化和行为缺失。这是由于K1347A 突变能够直接损害GTP 和GTPase 的区域，随之而来的是LRRK2 激酶的活性不被激活[15-19]。

该实验的研究人员认为人们可以利用目前的线虫模型作为一个平台，帮助人们研究体外突变的影响和发病机制，结果显示线虫内源LRK-1 的缺失能够抑制LRRK2 诱导的显型，也能抑制CAT-2 过度表达诱导的神经毒性。此外，已有报道，在果蝇中野生型LRRK2 和G2019S 的过度表达能够诱导神经退化[20]，在LRRK2 突变的转基因鼠模型中发现鼠变得聪明，R1441C 突变的转基因鼠表现出正常的行为，而且没有神经退化[21]。在哺乳动物模型中，这些LRRK2 相关的多巴胺线虫模型对于临床研究LRRK2 治疗多巴胺疾病是非常有用的工具。

3 阿尔茨海默病线虫模型

阿尔兹海默病（Alzheimers disease，AD）是发病率最高的神经退行性病变，其主要是由于β-淀粉样蛋白错误折叠引起的，是老年痴呆的一种，多发生于中年或老年早期。1995年，Link[22]将贝塔淀粉样多肽（1-42）（Abeta1-42）肽段编码基因转基因到秀丽隐杆线虫的肌细胞，线虫肌细胞内出现了硫黄素S（thioflavins S）阳性反应沉淀物和进行性运动麻痹的表型，这是第一个AD 的线虫模型。研究表明阿尔兹海默病主要成分是贝塔淀粉样多肽（1-42）（Abeta1-42），Abeta1-42 与该病发生紧密相关[23-24]。

有研究报道铜离子参与了AD 的病理发生[25]，该线虫模型主要用于研究Abeta1-42 与铜的相互作用及其产生的毒性。研究人员将线虫分别暴露于3 种不同浓度的铜离子（终浓度分别为10-3，10-4，10-6mol·L-1），结果显示，随着铜离子浓度增加，线虫瘫痪行为也显著增加，这表明在AD 的发病过程中，铜离子影响了Abeta1-42 的毒性发挥。此外，研究人员还发现铜会改变线虫体内金属元素的稳态平衡。这是由于Abeta1-42 与铜共同作用，改变了基因sod-1，prdx-2，skn-1，hsp-60，和hsp-16.2 的表达水平，引起活性氧堆积，导致线虫瘫痪。这些研究结果将为理解AD患者的神经细胞形态异常和功能障碍提供重要线索。

4 结论与展望

近年来，随着人们对线虫模型研究日益深入，秀丽隐杆线虫因其独特的优势，使之成为生物学家借以了解诸多基本生命现象的首选模型。通过转基因、突变体筛选等方法，人们已成功制备秀丽隐杆线虫的几种神经系统退行性疾病模型。研究秀丽隐杆线虫基因功能时，可以将绿色荧光蛋白与目的基因融合，帮助人们推断与之紧密相连的目的基因筛选的时间、表达的部位和表达数量的多少，便于观察。由于新秀丽线虫与人类的某些调控机制的相似性及其结构的简单性，可以利用秀丽线虫作为动物模型进行药物筛选。此外，秀丽线虫还可以在药物新靶点的发现和证实，药物机制研究，人类疾病模型的复制及药物干预，化学基因组和毒理学领域有广泛的应用前景[26]。可以预见，在不久的将来，使用秀丽隐杆线虫开创的神经退行性疾病机理的研究，将能在攻克各种未解决的疾病方面发挥重要作用。通过研究线虫的神经退行性疾病模型的调控机制，并将其成果应用于哺乳动物，对延长人的寿命及提高人的生活质量有很大意义。

短短几十年中，以秀丽线虫为研究对象取得的科研成果层出不穷，线虫已成为当代生命科学研究中的一个重要的模式生物。相信随着研究的深入，秀丽线虫将会为人类生命科学的探索做出更大的贡献。

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