蛋白C的检测方法及研究进展

陆松松，吴迪综述，贾玫审校

(北京大学人民医院检验科，北京 100044)

蛋白C是体内重要的抗凝血因子，其在体内的水平与年龄相关，多种因素可导致蛋白C缺乏。蛋白C缺乏症人群发病率为0.2%~0.5%，在血栓病患者中的发病率为5%~15%。大部分蛋白C缺乏症无明显的临床症状，2%的蛋白C缺乏症有明显而严重的临床症状[1]。 严重的蛋白C缺乏症会使凝血与抗凝及纤溶系统发生紊乱，从而引发血栓性疾病，如深静脉血栓形成、弥散性血管内凝血等，也有报道称蛋白C缺乏与早期流产相关。目前蛋白C的检测主要有三种，一是检测蛋白C的含量；二是检测蛋白C的功能；三是通过检测蛋白C基因PROC突变来诊断蛋白C缺乏。本文主要对蛋白C的检测方法及应用的研究进展进行综述。

1 蛋白C的性质及功能

蛋白C是维生素K依赖的血浆蛋白，它主要由肝脏合成，半寿期与凝血因子FⅦ相近，约为6h，比其它的维生素K依赖的凝血因子如FⅡ、FⅨ、FX要短。丝氨酸蛋白酶激活蛋白C，使之成为活化的蛋白C(APC)，APC与血管内皮上的内皮细胞蛋白C受体结合[2]。活化蛋白C具有下列功能：(1)灭活凝血因子FVa和FⅧa，降解凝血活酶的形成速度，产生抗凝作用；APC对因子Ⅴa和Ⅷa的灭活作用是迅速的，3μg/ml的APC在3min内，可使80%因子FVa、FⅧa灭活[3]；(2)APC能刺激内皮细胞释放tPA等纤溶酶原激活物，亦能灭活组织纤溶酶原活化抑制物(PAl)，参与促纤溶作用；(3)具酰基水解活性，对多种人工合成底物如S-2238、S-2366等起酰基水解作用。人体内血浆蛋白C含量有随年龄增长而增加的现象，每10年约增加4%[4]。

2 蛋白C基因(P R O C)

蛋白C基因位于染色体2q13-14，其基因序列共有10802个碱基，含有9个外显子(共1790bp)和8个内含子，而编码蛋白C的外显子有8个。该基因的多种突变与蛋白C缺乏症相关，目前，报道其超过300种变异体，且目前没有发现明显的种族及地区的差异。遗传型的蛋白C缺乏症为常染色体的显性遗传，75%为单碱基的错义突变或者无义突变，少数为片段缺失或者插入突变。蛋白C缺乏有两种表现：一种是蛋白C含量降低，活性降低；而另一种为蛋白C含量正常，而活性降低[5]。后者的变异体多为错义突变(http://www.itb.cnr.it/procmd/)。

3 通过血浆检测蛋白C缺乏的方法

临床上蛋白C常用枸橼酸钠抗凝血进行检测，国际上首次制定蛋白C检测的标准品是在1988年，利用冻干的蛋白C作为标准品来校准各实验室的仪器[6]。2006年，国际生物制品标准品及质控品委员会(NIBSC)再次对蛋白C的标准品进行了校准，目前，蛋白C检测具有可溯源的校准品。早期对蛋白C功能的检测主要是通过与凝血酶或者血栓调节蛋白与凝血酶的复合物反应，然后通过凝固法或者显色底物法来检测活化的蛋白C(APC)。但是此方法复杂且费用昂贵，随后很多实验室用免疫电泳法来检测，但是这种检测蛋白C抗原的方法不能分析其功能，不适用于蛋白C含量正常而功能下降的Ⅱ型蛋白C缺乏症的诊断。

现在，蛋白C活性的检测大多通过商品试剂ProtacR。ProtacR是单链的蛋白酶，由铜斑蛇毒纯化提取的产物。ProtacR能够极其快速地激活蛋白C使之成为APC，可以有效地排除蛋白C抑制剂对试验的影响。凝固法的试验是基于APC灭活FVa、FⅧa，从而引起血液凝固时间的变化，通过标准曲线定量蛋白C。显色底物法是基于显色底物氨基酸的分解，而测定比色程度来实现的。目前对于检测蛋白C缺乏的筛查比较推荐的方法是显色法，因为显色法干扰因素较少，且比凝固法准确[7]。

3.1 凝固法检测蛋白C 测定目标为蛋白C的抗凝活性，即对凝血因子FVa、FⅧa的灭活能力。本实验是一种基于活化部分凝血活酶时间(APTT)，首先将待检测的血浆蛋白C稀释，然后与缺乏蛋白C的血浆混合，加入APTT试剂，最后加入ProtacR。ProtacR将蛋白C激活为APC，APC灭活FVa、FⅧa，最终使APTT延长，检测结果可从抗凝时间标准曲线中读出，以百分数表示。如FⅧ含量过量以及FV Leiden突变，可导致检测结果的假性偏低；如果被检测血浆中含有狼疮抗凝物质，则检测结果假性偏高。这些影响因素可通过显色底物法来排除，或者结合抗原含量的检测来综合评估。对于FV Leidenn突变的样品，可行的方法是将样本与乏蛋白C血浆按照1:4混合，然后测定混合物蛋白C的活性，但当蛋白C含量极低的时候，会降低混合血浆检测方法的灵敏度。目前认为肝素含量低于1~2U/ml，不会影响凝固法的检测，但是当含有阿加曲班、水蛭素、比伐卢定等凝血酶抑制剂时，会使检测结果假性升高[8]。因此给予APTT的凝固法检测蛋白C活性的特异性不高一直是此方法的弊端。

凝固法的第二种类型是基于Russell蛇毒凝固时间(RVV-X)，此方法不受高浓度的FⅧ的影响(<1000U/ml)，且受到狼疮抗凝物质的影响也较小[9]。

凝固法检测蛋白C的活性是最接近蛋白C真实的生物功能的一种方法，因此长久以来一直在应用，但是此方法的特异性较差，干扰因素较多，因此，在临床检测时要结合其他的检测方法来最终确定蛋白C是否缺乏。

3.2 显色底物法检测蛋白C底物显色法通过测定产色底物的吸光度变化来推测所测物质的含量和活性的。显色底物为小分子的寡肽，其通过肽键与对硝基苯胺链接成为复合物。在待检血浆中加入ProtacR，使蛋白C激活为APC，APC作用于上述复合物中，断开肽键使对硝基苯胺脱落，从而使溶液呈黄色，在波长为405nm下的吸光度做标准曲线[10]。此方法中针对APC的显色底物缺乏特异性，也可被其他的酶水解为对氨基苯胺，从而显色，常见的干扰酶类有凝血酶、活化的FⅩa、激肽释放酶和组织纤维酶原激活剂等。这些酶类的干扰作用与实验室对样本分析条件有关。目前认为APC与底物作用的时间在5~10min就会产生非特异性裂解的氨基酸。而在相同的反应试剂下，30s的作用时间则会产生极少的非特异性产物。在通常的试验中，需要在校准品、质控品、检测样本中加入ProtacR，同时在另一份校准品、质控品、检测样本中加入水作为空白对照，以空白对照产生的吸光度OD值作为本底OD，但是有学者认为，当反应只有30s时，本底OD是极低的，Khor等对898例样本进行在30s反应时间下有无空白对照的对比试验，发现有886例结果偏差小于3IU/dl，7例偏差在3~5IU/dl之间，4例在4~5IU/dl之间，只有一例偏差为15IU/dl，因此Khor推荐的反应模式为：30s反应时间，只有样本来自DIC患者、含有组织纤溶酶原激活剂的样本或者采血缓慢的幼儿时才应用空白对照。这样可排除干扰物质的作用，缩短报告时间，同时节省试剂成本[8]。另外当肝素含量不超过2U/ml时不会影响检测结果，而且凝血酶抑制剂亦不会影响试验。

3.3 蛋白C抗原含量检测法 蛋白C抗原检测是指检测血浆中蛋白C的含量，而与其是否有活性无关。通常用到的方法有放射免疫扩散法、免疫电泳法以及酶联免疫吸附试验(ELISA)。虽然蛋白C抗原检测对于Ⅱ型蛋白C缺乏症不敏感，但是，当需要鉴别蛋白C缺乏的类型时，蛋白C抗原的检测有重要的作用，当一样本蛋白C含量正常，但是活性却很低的时候可以考虑其为Ⅱ型。对于用华法林的蛋白C缺乏症患者，蛋白C抗原的含量结合FⅦ、FX的水平来诊断其是否为Ⅰ型蛋白C缺乏症。值得注意的是，此时要使患者的INR在2~4之间，这样检测出来的FⅦ、FX才能与蛋白C进行PC/(FⅡ抗原+FX抗原)/2计算，以比值的方式与正常人做比较。对于存在维生素K抵抗的患者，不能应用蛋白C抗原的含量与依赖于维生素K的凝血因子进行比值计算分析[11]。

免疫电泳法检测蛋白C抗原，需要有特殊的仪器，实验时间较长，且电泳时需要对身体有害的钙螯合剂，因此目前应用较少。

早期ELISA方法受到类风湿因子的影响，产生假性的蛋白C升高。De Jager发现应用适当的阻断剂可以避免类风湿因子的干扰。Cooper等应用聚乙二醇沉淀法去除了非特异性的结合，避免了假性升高。同时发现，此方法对Ⅱ型蛋白C缺乏症的检测有重要的意义[12]。ELISA方法灵敏度高，可以检测到低于5U/dl的水平，检测结果无需推算，可以直接在标准曲线读出。

4 基因水平上的蛋白C检测

遗传性蛋白C缺乏症一般认为是常染色体显性遗传，但部分纯合蛋白C缺陷症患者表现为隐性遗传。基因检测蛋白C对于遗传性家族性蛋白C缺乏症有重要的诊断价值，同时对于产前诊断有重要的意义。另外基因检测可以对携带突变基因的人群进行分析。大多数PROC突变为杂合子型，其蛋白C活性与正常人群相近，或略低于正常人，无明显的临床症状[13]。基因检测若发现已经明确的变异体类型，则可排除获得性蛋白C缺乏症，对临床诊疗有重要的作用。目前认为基因检测蛋白C对于血栓形成风险的评估没有绝对性的意义，但是对于家族性蛋白C缺乏症有重要的诊断价值。

目前已经报道的突变有300多种，高加索人群最常见的为Arg230Cys,Arg178Trp,Gln132X,Val297Met and Pro168Leu，日本报道的主要突变有Phe139Val,Arg169Trp,Val297Met,Met364Ile,以及G8857del。Q.Ding等对23例中国汉族人群蛋白C缺乏症进行了基因分析，报道的突变位点为：Glu71 Lys ，Asp170Tyr，Cys175Tyr，Thr337 Ile,Leu386Pro，Trp414X。中国汉族人群蛋白C变异体的类型由于报道例数较少，因此尚不完善，有待于进一步研究，完成基因背景分析对以后的临床应用有一定的指导作用。

因为大多数的突变为点突变，因此首先要找到致病突变点，对PROC进行全外显子、剪接位点及启动子进行测序。如未发现致病突变，则需要Southern杂家的方法进一步检测是否有缺失突变，插入突变或者基因重排。一旦找到致病突变，则家系分析就变得容易了，也可以很快的找到携带者，并可估算其临床表现。

人类基因组突变委员会 (HGVS)推荐了检测DNA、RNA的标准方法，可在http://www.hgvs.org/mutnomen/,nomenclature for the description of sequence variants.中查到相关信息。另外关于PROC的参考序列NG_016323.1(genomic),NM_000312.3(mRNA)，NP_000303.1(protein) 可在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/中查到。

5 小结

蛋白C缺乏的筛选试验建议用显色底物法，因为此方法较凝固法特异性和准确度好。2006年Plebant M对实验室检查中的误差进行分析，发现分析前产生的误差约占 46%~68.2%[14]，2009年Lippi总结为分析前误差是实验室产生的主要误差[15]。蛋白C检测所需要的标本类型为枸橼酸钠抗凝血浆，若标本中含有凝块，会导致结果假性升高，如用血清或者肝素抗凝的标本，检测结果会偏高，而EDTA抗凝血会使结果减低[16]。实验室在检测过程中要有室间质评，目前本实验室采用的室间质量控制为美国病理家协会(CAP)提供的样本。在结果的回报中包含了数值和判断结果为正常或者异常，这就要求每个实验室要有自己的正常人群参考值，可以为自己统计或者依据文献报道进行验证的结果。

显色底物法较凝固法稳定性要好，但实验室的各种因素仍会影响其精密度，比如试剂的稳定性、分析仪的选择、环境因素、操作者的技能等。因此为了降低系统误差，要定期对仪器进行校准。

值得注意的是蛋白C缺乏的携带者其蛋白C活性及抗原数量与正常人接近，如要对其分析，需要采用蛋白C/[(FⅡ抗原+FⅩ抗原)/2]的比值与正常人群进行比较。在急性血栓形成时检测的蛋白C是不能判断其是否为蛋白C缺乏症的，Kovacs对254例静脉血栓栓塞患者进行了比对试验，在发生栓塞的24小时内检测其蛋白C，发现有10例蛋白C水平极低；对这10例进行跟踪，当患者抗血栓治疗后，重复检测发现其中的6例蛋白C水平正常[17]。因此在血栓形成倾向的检测试验中，建议急性血栓时期蛋白C的检测结果仅作为参考，在对此类患者的静脉血栓治疗不应考虑蛋白C的结果[18]。

对于纯合子的蛋白C缺乏症或者新生儿DIC患者，检测蛋白C时，其方法的灵敏度下限要小于正常值的5%。有报道称ELISA方法的灵敏度最好，可以准确检测出小于5%的蛋白C样本。凝固法分析通常是将样本进行5倍或10倍稀释，如对于低值样本，可进行2倍或3倍的稀释，这样可提高灵敏度。显色底物法检测低值样本其灵敏度是最不理想的，因为检测时没有预稀释，在低值标本中的本底效应就会凸现出来，要将本底排除再进行分析。因此在检测低值样本时，首先要确定检测方法的灵敏度，才能报告准确的结果。

蛋白C检测结果较低时应考虑：包括纯合子及杂合子在内的先天性的蛋白C缺乏；幼儿生理性低值；维生素K缺乏症；维生素K抵抗；肝脏疾病；肾脏疾病；弥漫性血管内凝血(DIC)；静脉血栓患者；自身免疫性疾病；天冬酰胺酶治疗的患者[19]。

总之虽然蛋白C检测有各种因素的影响，但其在蛋白C缺乏症的诊断及血栓性疾病的原因分析中有重要的作用。对其基因突变的分析也将成为研究热点，以弥补中国汉族人群的基因背景，为基因诊断提供依据。

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