D-异抗坏血酸的生产应用现状及前景

刘明霞，周 强，陈卫平，*

（1.江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌 330045；2.百勤异VC钠有限公司，江西德兴 334221）

随着食品工业的快速发展，食品抗氧化剂正在得到前所未有的开发与应用。随着科学技术水平的提高和人们食品安全意识的增强，不断发现人工合成的抗氧化剂具有一定毒性，能影响人体呼吸酶活性[1]，甚至还具有致畸、致癌的作用，对人体健康不利。人工合成的抗氧化剂逐渐引起人们的不安全感。所以一些合成抗氧化剂开始在很多的国家受到限制或禁止使用。1977年美国FDA（Food and Drug Administration）宣布食品中禁止使用2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）；1982年日本厚生省宣布禁用丁基羟基回香醚（BHA）和叔丁基对苯酚（TBHQ）。因此，生产高效、安全、无毒的抗氧化剂变得十分重要[2]。D-异抗坏血酸（EA）是一种水溶性新型生物型食品抗氧化剂，其安全性得到世界粮农组织和卫生组织（FAO和WHO）的认可，被证明是一种安全、高效、无毒的绿色食品添加剂[3]。天然食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠的研究主要集中在发酵生产上[4]。目前，D-异抗坏血酸在自然界的分布尚无报道，市场销售的异抗坏血酸均为人工合成[5]。EA的生产方法主要有间接发酵、酶法、基因工程法、间接发酵法、直接发酵法四种。D-异抗坏血酸（EA）及其钠盐（EN）的用途十分广泛，如作为食品抗氧化剂、助色剂、防腐剂，此外，在医药卫生、化工方面也有应用。当然其主要的用途仍在食品加工方面。伴随我国饮料、肉类、果蔬加工、水产品、焙烤等食品工业的快速发展，异抗坏血酸将具有十分广阔的应用前景。

1 D-异抗坏血酸的结构与性质

D-异抗坏血酸（erythorbic acid）又称赤藻糖酸、异维生素C，化学名为D-2，3，5，6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯酸。D-异抗坏血酸（erythorbic acid）的分子式为C6H8O6，分子量为176.14。D-异抗坏血酸是维生素C的光学异构体，其分子结构如图1所示。

D-异抗坏血酸为白色至浅黄色结晶性粉末或颗粒，无臭，味酸，干燥状态下在空气中相当稳定，但在溶液中遇空气则迅速变质。可溶于水、醇和吡啶；微溶于甘油。D-异抗坏血酸的生理作用与抗坏血酸相似，但抗坏血酸的作用只有VC的1/20，且无强化维生素的作用，也不会阻碍人体对抗坏血酸钠的吸收和利用[6]，摄取的异抗坏血酸在人体内可转变成VC。

2 D-异抗坏血酸的生产研究进展

2.1 间接发酵法

目前，国内外D-异抗坏血酸的生产普遍采用的是间接发酵法。间接发酵法生产D-异抗坏血酸是采用发酵与与合成相结合的方法。首先利用细菌将葡萄糖转化为2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KGA）[6-9]，再以2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KGA）或者2-酮基-D-葡萄糖酸钙（2-KGCa）为起始原料经酯化、酸化等工艺合成D-异抗坏血酸，这两种合成途径大致相同，只是在发酵液的处理和酯化上有点区别[5，10]。

间接发酵法常用的发酵菌种有假单胞菌属（Pseudomonas）、沙雷氏菌属（Serratia）、欧文氏菌属（Erwinia）、葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）和醋酸杆菌属（Acetobacter）等。

Stubbs等[9]首先从5-酮基-D-葡萄糖酸的发酵液中分离出1株食爬虫假单胞菌（Pseudomona reptilivora），为2-KGA高产菌株，对葡萄糖的转化率可达82%。Lockwood等[11]报道了荧光假单胞菌（Ps.fluorescens）、粘质沙雷氏菌（S.marcescens）和鸡血藤欧文氏菌（E.milletia）等在含有18%葡萄糖的发酵培养基中，可以生产2-KGA，其发酵转化率一般可以达到90%左右。

蒋明珠和白照熙等[7]用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluoresce）K1005和 球 状 节 杆 菌（Arthrobacter globiformis）K1022进行2KGA工业化生产。当发酵培养基中葡萄糖含量为18%时，对葡萄糖的发酵转化率平均可达91.7%

Hathaway[12]报道了一种变相的以2-KGCa为起始原料的合成法，即提取出2-KGCa后，其酯化收率为理论产率85%～90%；而后以2-KGA为原料，用理论计算量的硫酸处理2-KGA发酵液中的Ca2+后，然后加入2-KGA重量的约1.5倍体积的甲醇和少量浓硫酸，以理论产率83%左右的收率得到2-酮基葡萄糖酸甲酯（2-KGM），以甲醇为溶剂，在一定温度下加入NaOH或NaHCO3的悬浊液，2-KGM在碱作用下发生分子内酯交换和互变异构反应生成EN（异抗坏血酸钠）。然后加入定量的水，再经冷却、过滤，理论产率可达到85%左右。

张俊贤等[13]研究了甲醇和NaOH用量对转化反应的影响。研究结果表明，甲醇用量愈大，转化率愈高，EN质量亦好。当甲醇用量增加到一定程度时，转化收率及EN的质量再无明显变化（转化收率达理论产率的91%以上，EN纯度99%以上）；当NaOH的用量超过2-KGM的0.96倍（摩尔比）时，转化收率和EN的质量都有明显降低。

Jaffe和Pleven[14]采用硫酸酸化法除去发酵液中85%～97%的Ca2+及固形物后，采用脱色、离子交换的方法对发酵液进行处理。低温减压浓缩离子交换液至糖浆状（含水19%～30%），加入2-KGA重量的约3倍体积的甲醇和少量浓硫酸，在惰性气体如N2的保护下回流反应4.5～5.0h，2-KGM理论产率可达95%左右。原料的合成方法用于国内的EN工业化生产。

从提高合成收率和减少甲醇消耗量方面着手，国内学者对不分离2-KGM直接进行转化的工艺进行了研究，使得酯化、转化和精制步骤的收率接近70%。进一步研究的理论产率达86%左右，但由于生产设备等条件因素限制，该工艺在工业生产中难以得到实施[5]。

采用间接发酵法生产异抗坏血酸，虽然已经工业化生产，但2-KGA发酵生产中存在噬菌体流行的隐患，一旦大规模流行，将给生产企业造成巨大经济损失，同时间接发酵法提取操作工艺复杂，产品收率低，能耗高，在酯化的过程中，由于甲醇的消耗居高不下，造成生产的高成本，且酸化时要用得到强酸，对设备要求高，腐蚀性大。国内生产的产品的定性指标如澄明度、色度和异物上与国外产品存在一定差距[5]。虽然间接发酵法拥有比较成熟的工艺路线和技术，但相对于直接发酵，间接发酵法工艺复杂，产品收率低，耗能高，且国内的一些生产企业没有做到清洁生产和废物的综合利用，这与国家提倡的低碳经济相违背。

2.2 直接发酵法

通过在发酵培养基中接种真菌，可直接生产D-异抗坏血酸，能直接产生D-异抗坏血酸的菌种主要为青霉菌。直接发酵法的生产代谢途径包含两步：一是葡萄糖被葡萄糖氧化酶催化氧化成D-1，5葡萄糖酸内酯，D-1，5-葡萄糖酸内酯同时会转化成D-1，4-葡萄糖酸内酯，这是一步可逆反应，由于D-1，5-葡萄糖酸内酯在中性条件下不稳定，会水解成葡萄糖酸；二是葡萄糖酸内酯在葡萄糖酸内酯氧化酶的作用下，转变成EA，同时在转化的过程中有个未知的含有1，5内酯环的中间产物生成[11]。

自从1960年Takahashi[15]第一次发现青霉能直接发酵生成D-异抗坏血酸以来，经过近几十年的发展据报道国外的转化率达40%以上，发酵液中EA的积累达40g/L以上[16]，80年代以来，国内外学者也进行了大量工作。1981年赵胜临等[17]分离到一株产D-异抗坏血酸较高的菌株-5115，产量为21mg/mL。经过诱变得到了高产菌株-1505，其D-异抗坏血酸产量为40mg/mL，最高可达46.04mg/mL。

直接发酵法具有潜在的低成本技术优势，但是技术并不成熟，许多研究只是在在实验室条件下摇瓶发酵的结果，在实际生产发酵过程中有许多问题尚待解决。

直接发酵法的关键是筛选出能产生葡萄糖氧化酶和葡萄糖酸-γ-内酯氧化酶（或内酯脱氢酶）的菌株。虽然葡萄糖氧化酶广泛存在于真菌中，但是能产生葡萄糖酸-γ-内酯氧化酶的菌种很少，之前，有研究者认为似乎只有青霉属的一些种才能产生葡萄糖酸-γ-内酯氧化酶，但是2000年，Asakura等[18]的研究中指出大肠埃希菌（E.coli）和发酵单孢菌属（Z.mobilis）能产生葡萄糖酸-γ-内酯氧化酶，尖孢镰刀菌（F.oxysporum）能产生内酯脱氢酶。具体研究过的有大肠埃希菌（E.coli）IFO 14410葡萄糖酸内酯氧化酶，发酵单孢菌属（Z.mobilis）IFO 13756葡萄糖酸内酯氧化酶和尖孢镰刀菌（F.oxysporum）IFO 5942内酯脱氢酶。截至目前，我国没有这种内酯酶的相关研究。

直接发酵法发酵过程中适当的通入空气和补充葡萄糖是提高EA的产量和生产效率的主要因素，目前生产菌株的产酸水平不高，在经济指标上难以符合工业化生产的要求，又由于金属铁离子对青霉菌发酵产EA具有很大的抑制作用，即使铁离子浓度很低，其抑制作用也很明显，但目前其机理尚不清楚。由于二价金属离子和对-氯汞基苯甲酸盐对D-葡萄糖酸内酯酶具有抑制作用，显示巯基对于其酶活性的重要[19]，铁离子是不是会作用于葡萄糖氧化酶或葡萄糖酸内酯氧化酶的巯基，使其失活。

如果以上这些问题不解决，上罐发酵很难实现，更提不上直接发酵法生产EA的工业化。

2.3 酶法

酶法是指在一定的温度和酸度下，内酯酶（如葡萄糖酸内酯酶、内酯脱氢酶等）可以将溶液中的2-KGA转化为EA[5]。

Asakura等[18]在以2-KGA为底物，用分离纯化的运动假单胞菌和大肠埃氏细菌的葡萄糖内酯酶作为催化剂的转化体系中，其反应体系有4.7%的2-KGA和葡萄糖酸内酯酶的脂肪酸甲酯磺酸钠盐缓冲液组成，脂肪酸甲酯磺酸钠盐缓冲液浓度为167mmol/L，pH5.5，在反应中添加的运动假单胞菌的葡萄糖酸内酯酶的浓度为213μg/mL，在50℃无氧条件下反应20h；大肠埃氏细菌的葡萄糖酸内酯酶的浓度为180μg/mL，在70℃无氧条件下反应20h；以不添加酶作对照，然后用高效液相色谱法测定反应液中D-异抗坏血酸的含量，其含量分别为35.8mg/L和39.6mg/L[17]。目前，国内也尚无采用酶法生产异抗坏血酸的相关报道。

采用酶法生产异抗坏血酸，尽管酶具有高效性和专一性，没有底物的反馈抑制作用，反应步骤简单，但是葡萄糖酸内酯酶比较难得，酶的活性及其性质也并不清楚，酶的比率难以确定，且产率太低，工业应用价值很低。如果能从微生物中得到高活性的葡萄糖酸内酯酶，酶法生产D-异抗坏血酸将会在实际生产中得到应用。

2.4 基因工程法

基因工程法是将青霉中的糖内酯氧化酶的基因克隆到酵母中，并在酵母中表达，由此通过酵母来发酵生产异抗坏血酸。

糖内酯氧化酶广泛存在于动物植物微生物中[19]，各种糖内酯氧化酶（GLO）的特性如表1所示。

从表1可以看出青霉菌中葡萄糖酸内酯氧化酶的特性和其他的糖内酯氧化酶的特性有很大的区别，它是直接从灰黄青霉菌中分泌出来的可溶性蛋白酶[29]，且可以同时催化D-1，4葡萄糖酸内酯和D-1，5葡萄糖酸内酯[11]。

Tuomas Salusjärvi通过基因工程技术，将葡萄糖酸内酯氧化酶基因成功导入酵母中，并到达表达，通过摇瓶发酵144h后，产量为5.9g/L，产率0.04g·L-1·h-1[31]。

基因工程法虽然其产量还达不到工业化生产的要求，但是相对于酶法其产量大幅提高，且克服了铁离子对青霉抑制作用这一难题，为异抗坏血酸的直接发酵的工业化做出了重要的一步。通过基因工程法得到高产D-异抗坏血酸，并且发酵周期更短的菌株，这将是一个关于D-异抗坏血酸生产研究的重要课题和目标。

3 D-异抗坏血酸的应用

3.1 在食品工业中的应用

异抗坏血酸及其钠盐是安全、有效的食品添加剂，可用于糕点、面包之类粮食制品以及香肠、火腿肠之类肉制品中作抗氧保鲜剂。在肉类（如火腿肠、腊肉、香肠、熏肉等）、水产品、蔬菜的腌制过程中添加异抗坏血酸钠，可以代替硝酸盐发色，还能能防止亚硝酸胺类致癌物质的产生，可以抑制各种细菌的生长，改善食用制品的外观、色泽、风味。在水果、蔬菜保鲜方面，可以抑制果蔬本身的氧化酶类的活性，故能防止果蔬褐变现象的发生。

3.1.1 在腌制品中的应用 在肉制品或蔬菜制品的腌制过程中，其发酵过程中很容易产生亚硝酸盐类物质，人们经常食用含有亚硝酸盐类的酸菜很容易致癌。有研究[32]表明，目前已发现多种天然的或合成的食品中的组分对亚硝胺的形成有重要影响。抗坏血酸是最大的阻断者（阻断率能达到90%），其次是异抗坏血酸，由于异抗坏血酸的价格低于抗坏血酸，且抗氧化效果好，较常采用。在酸菜的腌渍过程中通过浸泡或喷洒的方式添加异抗坏血酸能有效地抑制亚硝酸盐的形成。将异抗坏血酸添加到肉制品中，能使发色剂亚硝酸盐产生更多氧化氮，可将正铁肌红蛋白还原为肌红蛋白，进而结合成红色的亚硝基肌红蛋白，防止肉氧化变味，减少亚硝胺的产生，效果较为理想。同时异抗坏血酸也具有加强亚硝酸钠抗肉毒杆菌的效果[33]。

3.1.2 在果蔬加工中的应用 新鲜果蔬产品由于加工创伤而导致微生物繁殖、软化、失重和组织褐变等质量问题，成为影响鲜切果蔬加工业发展的一大难题。传统的褐变抑制剂是硫，但由于硫可导致哮喘，在寻找硫的替代品中，研究最多的是抗坏血酸及其衍生物（如异抗坏血酸及其钠盐）[34]。

有报道将异抗坏血酸（钠）用于辣椒和黄瓜的保鲜。用异抗坏血酸钠溶液浸泡或喷洒到黄瓜上，室温下可保鲜20d左右[35]。也有研究表明，抗坏血酸对梨也有很好的保鲜护色效果。

覃海元等[36]通过研究比较了柠檬酸、异抗坏血酸钠处理和冷藏时间对鲜切菠萝品质（如颜色、硬度、失重）和包装内气体组成的影响，用0.8%异抗坏血酸钠处理的鲜切菠萝，研究结果表明，异抗坏血酸钠可显著延缓鲜切菠萝的颜色变化和软化，可减缓失重。这可能是由于异抗坏血酸能抑制组织的败坏和减缓代谢。D-异抗坏血酸无毒，可安全用于控制酶促褐变[37]。孙程旭等[38]研究了异抗坏血酸对新鲜马铃薯切片褐变的影响，并与其他三种褐变抑制剂（柠檬酸、Na2SO3和CaCl2）作了对比，研究结果表明，异抗坏血酸在马铃薯的护色保鲜上效果较好。

3.1.3 在肉制品水产品中作为护色剂的应用 在肉制品的加工中，常加入亚硝酸盐作为发色剂，可于亚硝酸盐对人体有害，许多厂家会加入天然红曲红色素作为肉制品着色剂，但使用红曲红着色的肉制品容易因光照和氧化作用而褪色。于功明等[39]对低温肉制品的护色剂进行了研究，实验结果表明，异抗坏血酸钠与茶多酚、柠檬酸、植酸组成的复合护色剂对低温肉具有良好的护色效果。

章鱼在加工过程中由于加热、美拉德反应、脂肪氧化等易引起变色反应，但用0.3%的异抗坏血酸钠处理，在加工和冷藏过程中其色泽没有明显的变化[40]。这对于章鱼深加工，促进出口，满足国外客户的要求和增加渔民的收入都具有积极的意义。

甘伯中等[41]研究发现，异抗坏血酸钠对干酪素的色泽改善效果与异抗坏血酸钠的添加量有一定的关系。在一定范围内，异抗坏血酸钠使用量增加，干酪素色泽改善效果不一定就好。其主要的机理是酪蛋白溶液中的美拉德反应随异抗坏血酸钠的增加而不断减少，减小到一定程度时，即使增加异抗坏血酸钠的用量，也没有明显效果。从某种程度来说，这就可以为工厂减少异抗坏血酸钠的用量，从而减少生产成本。

3.1.4 在啤酒、饮料中的应用 异抗坏血酸及其钠盐作为抗氧剂在饮料啤酒等中应用广泛，在食品饮料中，它可根除食品饮料的变色、异味和混浊等不良现象，解决饮料口味欠佳的问题。在啤酒中能去除陈腐气味，增强啤酒风味稳定性，给啤酒提供多重的抗氧化保护，延长啤酒的保质期。

3.1.5 在米面制品中的应用 鲜面条放置时会发生褐变，异抗坏血酸可以明显降低面条的褐变速率，而且对于改善面条的品质方面也起到了积极作用，不失为一种好的面条添加剂[42]。

3.1.6 在油脂中的应用 由于异抗坏血酸及钠盐是水溶性的，脂溶性较差，在油脂的抗氧化方面的应用受到一定的限制，但与一些脂肪酸形成脂肪酸酯后，脂溶性的问题得到解决且抗氧化性能变化不大，如添加0.044%异抗坏血酸豆蔻酸酯到菜籽油中能起到很好的抗氧化性能力[43]。D-异抗坏血酸棕榈酸酯对共轭亚油酸具有良好的抗氧化作用[44]，可延长共轭亚油酸的货架期且安全性高。异抗坏血酸及其钠盐作为抗氧化剂，主要是其可除去弥漫于食品中的氧气，从而延缓氧化反应的发生[45]。

3.2 在其他方面的应用

3.2.1 在医药方面 异抗坏血酸具有降血压、利尿、肝糖原生成、色素排泄、解毒等作用[46]，可用于肝胆显像或骨骼显像；可由于肾结石的治疗；可作为药品、药品或卫生用品的辅助材料。

3.2.2 在化工方面 异抗坏血酸可以稳定化学反应的及缓和反应速率，可作为化工原料的稳定剂，除氧、抗蚀和除垢溶剂的重要组分，油田地层酸化处理的化学添加剂，电解、电镀中的电解质；可用于金属微粉的生产和贵重金属的回收和一些高分子聚合物的制取[5]；异抗坏血酸有脱臭效果可用作脱臭剂，可用于处理纸浆和吸附空气的臭味。

3.2.3 其他方面 此外，在农业、军工、纺织、摄影、勘探等方面也有应用[5]。在纺织工业中，用异抗坏血酸预处理将印染的纺织物，可使纺织物的白色部分免受污染；在兵器工业中，在炸药或弹药中添加异抗坏血酸，可以改变炸药和弹药的性能；在建材工业中，异抗坏血酸可以用来处理未凝固的混凝土。

4 展望

随着国内外社会上对食品质量和安全的广泛关注，抗氧化剂是当今世界各国食品添加剂行业研究的一项重要内容，特别是安全、无毒、高效的抗氧化剂，是各国科学家研究最多的一个领域。异抗坏血酸作为品质卓越的水溶性绿色环保抗氧化剂，越来越受到青睐，在国际上应用十分广泛，多年来市场需求一直稳步上升[47]。但是和发达国家相比，我国异抗坏血酸无论是应用领域还是使用量都还非常小。随着我国人民生活水平的不断提高，食品工业将会得到更快的发展，异抗坏血酸作为绿色环保食品添加剂，其市场发展前景不可估量。

目前间接发酵二步法生产异抗坏血酸虽然技术相对成熟，但工艺复杂，耗能高，这与国家提倡的低碳经济相违背，且技术水平与国外存在较大差距。一步发酵法生产的异抗坏血酸所具有的安全性和可靠性得到保证，且直接发酵法可以降低成本，降低能耗，因此研究开发一步发酵法的生产工艺具有十分广阔的应用前景。酶法和基因工程法生产异抗坏血酸有着潜在的优越性，但技术上存在难关，有待攻克。如果直接发酵法、酶法和基因工程法生产异抗坏血酸的研究有所突破，异抗坏血酸的生产研究将会有一个飞跃，将会使异抗坏血酸取得更广阔的应用空间。

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