富锗木耳对小鼠肠道菌群的影响

陈宏伟，朱蕴兰，高兆建，张 城

（1.徐州工程学院，江苏徐州 221111；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点实验室，江苏徐州221111；3.江苏省食品生物加工工程技术研究中心，江苏徐州221111）

木耳（Auricularia auricula），又称黑木耳，在生物分类学上属于真菌门，担子菌纲，木耳目，木耳科，是人类常见的食用菌之一，其色泽黑褐，质地柔软，味道鲜美，营养丰富，易于消化，老少皆宜，不仅可以作为食用，而且还可以作为药用。木耳含有多种营养物质如：糖类、脂肪、蛋白质、铁、钙、磷、核酸、粗纤维等成分。它具有益气强身、益智健脑、强精补肾、清肺益气、镇静止痛、舒筋活络、滋阴润燥之功效，还具有降低血压、血脂、抗凝血、抗血栓、抗辐射、抗衰老、消炎和增强机体免疫功能的作用，而且能促进核酸、蛋白质的生物合成和防治多种老年性疾病的发生，并具有一定的抗肿瘤和治疗心血管疾病的功效[1-2]。锗属于稀有元素，在土壤、植物中的含量较低，且具有毒性。研究发现，有机锗是一种广谱性的药物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗衰老，具有消炎与免疫调节等作用，对微生物的生长、改善血液循环、增加携氧量有促进作用[3]。食用菌菌丝体对锗富集能力较强，可以使无机锗通过菌丝体的转化作用转化为有机锗，降低毒性，增加有机锗的利用率，提高锗的生物效应，并可改善食用菌的品质。有关食用菌对锗富集的研究已有一些[4-5]，但木耳对锗的富集研究尚未见报道，本研究试图通过木耳的生物转化作用将无机锗转化为有机锗，并研究富锗木耳对小鼠肠道菌群的影响，为进一步开发木耳产品，提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木耳（Auricularia auricula） 江苏徐州丰县大山河食用菌生产基地；大肠杆菌和乳酸杆菌 徐州工程学院实验室保藏；昆明小鼠（kunming mice） 徐州医学院实验动物中心；斜面培养基 葡萄糖4%、酵母膏1%、蛋白胨1%、琼脂2%、去离子水；液体种子培养基葡萄糖3%、蛋白胨1%、麦麸1%、豆粉1%、硫酸镁0.15%、磷酸二氢钾0.2%、氧化锗（350μg/mL）、去离子水；发酵培养基 同液体种子培养基；锗标准液 国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院；氧化锗 国药集团化学试剂有限公司。

HYG-Ⅱ型回转式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化有限公司；GPH-9160型隔水式恒温培养箱 上海一恒精密仪器有限公司；GZX-DH40X45-BC型电热恒温干燥箱 上海跃进电器器械厂；HH-4型数显恒温水浴锅 华国电器有限公司；FA-210N型电子分析天平 上海精密器械有限公司；YXQ-SG41-280型手提式压力蒸汽灭菌器 上海医用核子设备厂；82-1型低速离心机 常州国华电器有限公司；PHS-3CA型酸度计 上海世义精密仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工有限公司；XT-9900型智能微波消解仪 中国上海新拓微波溶样测试技术有限公司；XT-9700型冷却机 中国上海新拓微波溶样测试技术有限公司；XT-9800型多用预防处理加热仪 中国上海新拓微波溶样测试技术有限公司；TAS-990型原子吸收分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；3-30K型高速离心机

德国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 木耳富锗培养 活化后的菌种→斜面培养（23℃，5～7d）→摇瓶种子培养（250mL三角瓶装样量100mL，23℃，120r/min，5～7d）→富锗扩大培养（10%的接种量接入含锗的发酵培养基，23℃，120r/min，5～7d）。

1.2.2 木耳菌丝体干粉的制作 将发酵液经减压抽虑得到菌丝体，然后将菌丝体置于50℃干燥箱中干燥至恒重，研磨成粉末，装入小塑料袋，放入干燥器内备用。

1.2.3 木耳菌丝体生物量的测定 将发酵液抽滤得菌丝体，经干燥至恒重，称量，即为生物量。

1.2.4 木耳菌体中有机锗含量测定 a.菌丝粉用透析袋透析2d，每天换2～3次水，将其中的无机锗透析掉[6]。b.微波消解（微波消解阶段设置：功率为80%，压力为10kPa，第一阶段时间300s），得到消解液于冷却机中赶酸30min，定容到10mL容量瓶中，待测[7]。c.锗含量测定用TAS-990型火焰原子吸收分光光度计（波长265.2nm，工作电流5mA，燃气流量2000mL/min，燃烧高度5.0mm，负高压350V，光谱带宽0.4nm）测定其吸光度，并通过标准回归方程计算该样品中有机锗的含量[8]。d.锗标准曲线绘制：于10mL容量瓶内准确取1mL锗标准溶液，加1%硝酸定容。分别取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL于1mL容量瓶中，加5μg基体改进剂硝酸镍[9]，用1%硝酸定容，用上述方法c测定，并求回归方程。

1.2.5 小鼠实验分组 将30只小鼠分成三组，第一组（10只）：小鼠正常饮食；第二组（10只）：灌胃生理盐水（每只每天1次0.2mL，喂21d）；第三组（10只）：灌胃富锗木耳菌丝体（每只每天1次富锗木耳菌丝体75mg/0.2mL，灌胃21d）。

1.2.6 肠道粪便菌群样品的收集 在灌胃之前和灌胃后第21d分别在无菌条件下轻轻地挤压小鼠的直肠部位，收集新鲜的小鼠粪便。并将收集的小鼠粪便装于先前灭菌好的EP管中，每组的实验小鼠收集3个粪便标本。迅速将EP管封口，记录重量，-20℃冷冻保存[10]。

1.2.7 粪便样品中DNA提取和纯化 a.DNA的提取按照杨美芬等[11]的方法，在粪便样本中加入9倍的体积PBS溶液（0.05mol/L，p H7.4）中充分混匀，低速离心（1500r/min 5min），取上清，并重复上述过程3次，合并上清液。然后高速离心（10000r/min 3min）后取沉淀，沉淀用PBS洗3次，水洗一次，加入50μL水和50μL 1%TritonX-100，100℃煮沸5min立即投入事先准备的冰冻水中，以备后面使用。b.DNA的纯化 将上述提取步骤中所得液体进行高速离心（14000r/min 1min）取上清液，接着加入相同体积的4℃的酚和三氯甲烷，振荡10s，再高速离心10min取出上清液，接着加入2～2.5倍4℃ 95%乙醇，液氮冷冻20min，接着用高速离心机离心1min，取出沉淀，用无水乙醇重复进行上述步骤，再沉淀一次，待挥干乙醇后，加入50μL的TE，放入冰箱中于-20℃保存。

1.2.8 DNA标准品的制备 取培养好的大肠杆菌和乳酸菌菌液，用血球计数板确定浓度（大肠杆菌浓度为4.0×107cfu/mL，乳酸菌浓度为1.8×107cfu/mL）取1mL菌液，10000r/min离心3min，PBS清洗，破碎，纯化步骤同1.2.7（b）。

1.2.9 荧光定量PCR反应

1.2.9.1 引物的设计 根据大肠杆菌的16S rDNA基因序列设计大肠杆菌菌种特异性PCR引物，并在BLAST基因库上进行比较[11]。

1.2.9.2 引物特异性 取DNA标准品和之前收集好的粪便样品DNA进行常规的PCR反应，反应体系为25μL：10×Buffer 2.5μL，0.25mol/L 4×dNTP 0.5μL，25mmol/L MgCl22.5mL，2μmol/L上下游引物各0.5μL，5U/μL Taq酶0.15μL，DNA模板3μL，水15.35μL。PCR反应程序为：95℃ 5min后，95℃ 15s，55℃ 1min，72℃45s共35个循环，最后72℃[12]10min结束。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。

1.2.10 标准曲线的制作 将所得DNA做10倍系列稀释，进行SYBR GreenⅠ作为实时定量PCR反应的荧光染料。反应的体系25μL：SYBR Premix Ex Taqtm 12.5μL，ROXReference Dye 0.5μL，上游和下游的引物各0.5μL，模板2μL，水9μL。同时采用ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System来扩增。反应的程序为：在95℃下预变性5min后，95℃ 15s，60℃ 1min，80℃10s，进行40个循环。待反应完成后，温度从60℃到95℃缓慢的升温，并检测荧光数据。根据读取的上述荧光数据，运用系统软件自动分析Ct值，自动生成相应的标准曲线。

2 结果与分析

2.1 富锗木耳菌丝体有机锗含量

经测定，获得的锗标准回归方程为y=0.065x+0.0037，R2=0.9826，根据标准回归方程测得木耳菌丝体有机锗含量为536.3μg/g。

2.2 小鼠肠道菌群DNA的PCR扩增结果

小鼠肠道大肠杆菌和乳酸杆菌的DNA扩增产物结果如图1所示。

从图1可以看出引物的特异性很好，粪便样品中的大肠杆菌和乳酸杆菌的DNA扩增结果与标准品DNA扩增的结果有极高的吻合度，可以作为荧光定量PCR引物使用。

2.3 富锗木耳对小鼠肠道大肠杆菌及乳酸杆菌数量的影响

经荧光定量PCR反应，大肠杆菌和乳酸杆菌16S rDNA的数量标准曲线如图2和图3所示。

将粪便DNA样本分别进行2种细菌的16S rDNA荧光定量PCR反应。反应体系与标准曲线一样，每次实验的同时做出相应的标准曲线。样品根据标准曲线得到各样品中2种细菌的数量，见表2和表3。

表2 富锗木耳菌丝体对小鼠肠道大肠杆菌的影响（lgCFU/g，±s，n=10）Table 2 Effect of mycelium Ge enriched on the E.coli in intestines of mice（lgCFU/g，±s，n=10）

注：小写字母不同表示差异显著，p<0.05；大写字母不同代表差异极显著，p<0.01；表3同。

灌胃前 灌胃后正常喂养组 6.087±0.099a 6.226±0.138a 0.2mL/每只（富锗菌丝体）组 6.126±0.200a 6.074±0.201a 0.2mL/每只（0.9%NaCl）组 6.130±0.193a 6.031±0.214a

表3 富锗木耳菌丝体对小鼠肠道乳酸杆菌的影响（lgCFU/g，±s，n=10）Table 3 Effect of mycelium Ge enriched on the L.lactis in intestines of mice（lgCFU/g，±s，n=10）

灌胃前 灌胃后正常喂养组 7.750±0.098a 7.698±0.080B 0.2mL/每只（富锗菌丝体）组 7.737±0.055a 8.246±0.189A 0.2mL/每只（0.9%NaCl）组 7.744±0.043a 7.681±0.129B

经Duncan新复极差法对数据进行多重方差分析表明，灌胃前、后各实验组之间的大肠杆菌数量无显著差异，喂饲富锗木耳菌丝体组小鼠肠道中大肠杆菌与未喂饲富锗木耳菌丝体组小鼠肠道内大肠杆菌的数目无明显变化，大肠杆菌的生长繁殖没有受到显著的影响；而喂饲富锗木耳菌丝体小鼠的肠道中的乳酸杆菌与未喂饲富锗木耳菌丝体组小鼠肠道内的乳酸杆菌的数目有显著区别（p＜0.01），富锗木耳菌丝体可以对小鼠肠道内乳酸杆菌的生长繁殖起到一定的促进作用。

3 结论

富锗木耳菌丝体对小鼠肠道中大肠杆菌的繁殖没有显著影响，对小鼠肠道中乳酸杆菌的繁殖有显著的促进作用（p＜0.01）。本实验表明，富锗木耳对调节小鼠肠道菌群平衡，促进有益菌繁殖具有显著效果。

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